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SchB对UVA损伤HaCat保护作用的讨论

来源:www.timetimetime.net 时间:2019-10-16 编辑:智慧

随着大气臭氧层的破坏,紫外线对人体皮肤的伤害也越来越严重,包括长波紫外线(UVA,320-340 nm)和中波紫外线(UVB,290-320 nm) )。 UVA比UVB对皮肤的损害更大,这会导致皮肤真皮中的胶原蛋白和弹性纤维降解,皮肤的感光反应,皮肤免疫功能降低和皮肤肿瘤形成。五味子素B(SchB)可以抑制大鼠肝质膜中丙二醛(MDA)的增加[4],并在氧化损伤下维持细胞的稳定性。在四氯化碳引起的大鼠肝细胞脂质过氧化损伤模型中,SchB可以减少肝细胞中MDA,乳酸脱氢酶(LDH)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的释放,肝细胞的存活率很明显。提高。 SchB还减轻了过氧化氢(H2O2)对心肌细胞的氧化损伤,这表明MDA和LDH减少,而谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性增加。但是,SchB在皮肤抗衰老方面的研究较少。本研究旨在研究SchB是否对UVA照射后永生化的人类角质形成细胞(HaCat细胞)具有保护作用,并探讨其保护机制。

1材料与方法

1.1主要仪器和试剂

NikonTS-100倒置显微镜;台式紫外线辐射仪(上海,西格玛);苏州净化设备有限公司SW-CJ-2FD双面单面净化站;三洋公司MCO-AC型CO2细胞培养箱;多功能酶标准仪器,Thermo Scientific。 DMEM液体培养基是天润盛大公司的产品;胎牛血清(FBS)购于中国医学科学院血液研究所。二甲基亚砜(DMSO)考马斯亮蓝G250是FLUKA产品;胰蛋白酶),DMSO购自GIBECO。 SchB的相对分子质量为400,由天津武警后勤学院生物制药系陈宏教授的研究实验室提供。体外实验是在DMSO中进行的。

1.2实验分组和辐照方法

将含有传代的HaCat细胞的培养瓶在5%CO2恒温箱中培养,在10%FBS的低糖DMEM中培养,每天更换。实验设于对照组(无UVA照射),模型组(UVA照射剂量为1、5、10、15 J/cm2)和ShcB 14组(UVA照射后,ShcB 0.1、0.01)。分别添加0.001、0.000 1(Mmol/L)。 UVA波长为320至400 nm,照射距离为1 cm。倒出各组的细胞培养液,用PBS洗涤两次,然后用适量的冷PBS覆盖。照射后,加入无血清培养基继续培养,并测定细胞活力以确定适当的照射强度。用适当强度的UVA处理HaCat细胞,并在UVA损伤后给予不同浓度的SchB来处理HaCat细胞。

1.3噻唑蓝(MTT)实验

用胰蛋白酶消化对数生长期的hacat细胞制备细胞悬液。将细胞悬液浓度调整为1.5×105个/ml,加入96孔板中,每个孔100μl。培养36小时后,用uva处理细胞。每组设6个复合孔。shcb组在uva照射2小时后加入不同浓度的schb。连续培养24小时后,在每个孔中加入50μl的mtt,在37℃的5%co2培养箱中加入dmso 4小时。在振荡器上振荡4分钟后,在酶标550nm处测量光密度(od)。计算细胞存活率为1-(对照组od值-模型组od值)/对照组od值。

1.4氧化损伤实验

取对数生长期的hacat细胞,用胰蛋白酶消化制备细胞悬液。细胞悬液在10cm培养皿中以1×105细胞/ml的浓度培养,设对照组、模型组和shcb 1-4组,置于5%co2培养箱中。培养36小时后,用5j/cm 2 uva照射细胞2小时。培养24小时后取shcb 1-4组上清液酶。生化法测定细胞外gsh-px、sod、ldh和no含量。

1.5统计方法

采用spss 17.0软件进行统计分析。实验数据用x+s表示,各组均数用单因素方差分析比较,组间多重比较用lsd-t检验分析,p<;0.05有显著性差异。

2个结果

2.1对照组、模型组1、5、10、15J/cm~2细胞存活率分别为(100.00(+6.31)%,(98.10(+5.78)%,(75.05(+8.64)%,(66.10(+5.61)%和(53.71(+2.59)%。差异有显著性(F=18.805,P<;0.01)。随着uva照射剂量的增加,hacat细胞的存活率逐渐降低。初步实验发现,当hacat细胞存活率低于70%时,加入schb后,损伤的hacat细胞几乎不增殖。gsh-px、sod、ldh与no几乎没有差异,这与实际情况不符。因此,选择5j/cm~2作为实验辐照剂量。

2.2不同浓度的schb对uva损伤后hacat细胞的保护作用以schb 3组最高,但随着schb浓度的降低,schb的保护作用减弱。

2.3比较不同浓度schb对hacat细胞gsh-px、sod、ldh和no含量的影响。模型组gsh-px、sod活性降低,ldh、no含量升高(p<;0.05)。与模型组相比,schb 1-4组sod活性、ldh和no含量升高,除schb 4组外,schb1-3组gsh-px活性升高。

3讨论

UVA辐射诱导细胞产生活性氧(ROS)。 ROS攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸,发生脂质过氧化反应,产生更多的ROS,导致皮肤细胞DNA发生光损伤,表现为对皮肤表皮和真皮的损害。 SchB是五味子中的一种单体活性成分,可以清除肝细胞中的自由基和脂质过氧化物,并增加肝细胞中抗氧化酶的表达。侯伟等研究发现,SchB可以减轻H2O2对HaCat细胞的氧化应激损伤,从而起到保护作用,类似于本实验的结果。在该实验中,发现SOD,GSH-Px的保护指数以及皮肤中LDH和NO的含量表明,当浓度降低至0.001时,随着SchB浓度的降低,对HaCat细胞的保护作用更强。 μmol/L时,保护作用最强。因此,SchB浓度越高,保护作用越强,而0.001μmol/L的SchB是最佳浓度。浓度过高和过低的保护效果都不好,其原因有待进一步分析。

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