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人参皂苷Rh2对LoVo细胞迁移和转移能力的影响及机制讨论

来源:www.timetimetime.net 时间:2019-10-30 编辑:影视

我国结肠癌的发病率逐年上升。综合化疗和生物治疗可提高患者5年生存率。然而,该药本身的毒副作用极大地限制了其应用范围。随着传统医学的复兴,越来越多的中药和中药单体被用于临床科学实验。人参皂苷RH2是从人参中分离纯化的单体。它在各种肿瘤的研究中有着重要的作用。研究表明,rh2能有效抑制人肝癌细胞smmc-7721和人结肠癌细胞caco-2。而ht-29、小鼠宫颈癌细胞株u14、人食管癌细胞株eca-109、马立克氏病肿瘤细胞株msb-1、人白血病多药耐药(mdr)细胞株k562/vcr增殖,提高免疫力,引起肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤生长抑制。但人参皂苷rh2抗结肠癌转移的实验研究未见报道。

目前,经孔实验主要用于研究肿瘤细胞的体外转移能力。通过检测肿瘤细胞在体外的迁移和侵袭能力,确定肿瘤细胞的转移能力。本研究拟采用经孔法检测人参皂苷rh2对结肠癌lovo细胞迁移和侵袭的影响,并探讨其分子机制。

1材料和方法

1。1个细胞和试剂

人结肠癌LoVo菌株由香港科技大学提供; Rh2购自上海亚吉生物技术有限公司(目录号A0241,纯度大于982.6 mg/g),并溶于二甲基亚砜(DMSO)中形成10 mmol。将/L母液冷冻保存;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma。胎牛血清,用于细胞培养的液体培养基RPMI-1640和2.5 g/L胰蛋白酶购自美国Gibco,胶原蛋白预涂的Transwell(目录号3422)购自美国康宁;兔抗人β-微管蛋白(BM1453),β-连环蛋白(BA0426),CD44(BA0321),基质金属蛋白酶MMP2(BA3716),基质金属蛋白酶抑制剂TIMP2(BA0576-2)和E-钙黏着蛋白(BA0475-2)抗体从武汉博斯特生物工程有限公司购买。

1. 2种主要乐器

博迅SW-CJ-2F双面双面净化工作台(中国上海博迅实业有限公司医疗设备厂); Thermo Fisher Scientific细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific); Motic AE2000倒置显微镜(中国麦克)奥迪工业集团有限公司; IX71荧光显微镜(日本奥林巴斯); i'Mark 680酶标仪(美国Bio-Rad); Bio-Rad电泳膜转移装置(美国Bio-Rad)。

1. 3 MTT方法的确定

不同浓度Rh2对LoVo细胞增殖的影响将5×103 /孔的LoVo细胞接种在96孔板中,在完全培养基中培养过夜,并用0、5、10、20、40、60μmol/L Rh2处理,分别在24小时,24小时,48小时,72小时的每个浓度下制备6个平行孔,并使用酶联免疫吸附测定法在490 nm下测量每个孔的吸光度(D)值。

1. 4 Rh2 vs. LoVo

细胞迁移的影响将细胞密度为5×105细胞/mL的LoVo细胞铺板在24孔板中(每孔500μL),并添加含有10%胎牛血清的RMPI-1640培养基并培养16-24 H。形成单层细胞,用无血清培养基代替,继续培养过夜;用200μL移液器吸头在单层细胞上进行“刮擦”刮擦,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次;通过添加5、10、20、40、60μmol/L无血清培养基制备Rh2溶液,并将2个样品孵育24小时。在倒置荧光显微镜下观察细胞并照相。最后,通过计算爬入``一个''划痕的空白区域的细胞数量来反映细胞迁移能力。

1. 5 Rh2对LoVo细胞转移的影响

将待测细胞培养至对数生长期,将细胞消化并用PBS和无血清培养基洗涤一次;将细胞悬浮于无血清培养基中,计数,调节至浓度为2×105/mL,在24孔板(在房间下方)中加入600μL含15%血清的培养基;上室与70μL无血清培养基培养箱孵育3 min,加入培养基,加入100μL不同浓度人参皂苷Rh2处理的细胞悬液。继续在培养箱中孵育24小时,小心地用镊子移出培养箱,吸干上部培养箱中的液体,转移至预先添加约800μL甲醇的孔中;在室温下固定30分钟,移走腔室,吸干上腔固定液,并移至预孔中。向孔中添加约800μLGiemsa染料溶液;在室温下染色30分钟,用PBS轻轻冲洗几次,取出培养箱,吸出上层培养液,然后用湿棉签小心地擦拭上层膜表面的细胞。用小镊子小心地除去膜,并向上干燥底部;移至幻灯片,并在显微镜下随机计数9个具有相同大小的视野,然后对结果进行计数。最后,通过计数跨膜细胞的数量来反映细胞转移能力。

1. 6 Western blot检测

在文献中描述了表达CD44,MMP2,TIMP2,ECadherin和β-catenin的具体方法。裂解并提取Rh2处理后的细胞,然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离。打印。密封转移的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后,依次添加相应的一抗和二抗,并将膜在发光液中孵育,然后通过化学发光荧光成像系统扫描图像,最后扫描蛋白质条带显示为灰色。学位分析。

1. 7统计方法的应用

spss 17.0数据统计分析软件。测量值表示为平均值(+标准差)(x(+s)。两组比较采用t检验,多组比较采用单因素方差分析,两组比较采用snk-q检验。α=0.05,p<与0.05有显著性差异。

2个结果

2.1 rh2对lovo细胞活性的影响

为了排除药物毒性或细胞增殖对lovo细胞迁移转移的影响,采用mtt法检测不同浓度rh2对lovo细胞生长的影响。表1显示,与空白对照组相比,5、10、20和40微摩尔/L浓度的rh2处理24小时后,对LoVo细胞的生长没有明显抑制作用,两组之间没有显著差异。当rh2浓度在60μmol/L以上24小时,浓度在40μmol/L以上48小时,浓度在20μmol/L以上72小时,lovo细胞发育。lovo细胞的长度明显受到抑制(p<;0.05或p<;0.01),说明人参皂苷rh2对lovo细胞活力的影响是时间和浓度依赖的。因此,在后续实验中,rh2的浓度控制在40μmol/L以内,作用时间为24小时。

2.2 rh2对lovo细胞迁移的影响

结果表明,随着药物浓度的增加,5-60μmol/L的rh2对LoVo细胞迁移的影响增大。20μmol/L及以上浓度的rh2对雷沃细胞作用24小时,与空白对照组比较,有显著的抑制作用(P<;0.05)。

rh2对lovo细胞转移功能的影响

结果表明,随着药物浓度的增加,rh2对lovo细胞转移的影响增强。RHO2浓度高于20微升/L的LoVo细胞治疗24小时,与空白对照组比较有显著性抑制(P & lt;0.05)。结果与抑制迁移一致。

cd44、mmp-2和

timp-2、e-cadherin和β-catenin表达的影响

cd44、mmp2和timp2、e-cadherin和beta-catenin的表达随rh2浓度的增加而显著下降(p<;0.05),显著升高(p<;0.05)。

3讨论

结肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤。后期治疗无效。恶性肿瘤的侵袭转移是死亡的主要原因。人参皂苷rh2单体可抑制肿瘤细胞生长,诱导细胞凋亡,逆转其异常分化,抑制肿瘤转移能力,联合化疗药物可提高疗效,减少副作用。研究结果表明,一定浓度的人参皂苷rh2能显著抑制lovo细胞的迁移和转移,且抑制作用随药物浓度的增加而增强。结果与陶丽华、朴丽华、金、姚兴军等有关。有报道显示,明显抑制肿瘤细胞迁移和转移的能力是一致的。肿瘤细胞的转移能力与肿瘤细胞中异常表达的某些分子密切相关。β-catenin和e-cadherin基因介导细胞粘附并与细胞粘附分子cd44相互作用,其低表达有助于肿瘤细胞的扩散和转移[18-20]。细胞基膜的降解是肿瘤远处转移的重要因素。基质金属蛋白酶(mmps)和组织抑制因子(timp)的平衡在维持细胞基膜完整性中起着重要作用。β-catenin和e-cadherin基因表达上调,促进细胞粘附,下调mmp2和上调timp2基因表达,防止细胞外基质降解,进一步降低cd44基因与远处转移粘附分子的表达,从而抑制cd44基因的表达。肿瘤侵袭转移的作用。

恶性肿瘤的主要生物学特征之一是肿瘤的侵袭和转移。恶性肿瘤从原位增生性病变发展到侵袭转移是一个复杂的过程。它与许多原因分不开,如降解酶、黏附分子、癌细胞的运动能力及其受体等。细胞外基质的降解和基底膜的完整性与恶性肿瘤密切相关。破坏是癌细胞完成侵袭转移的前提。基底膜是阻止肿瘤细胞浸润和扩散的天然屏障。正常基底膜是由iv型胶原等成分组成的致密网状结构,其固有细胞不能正常通过。细胞外基质的降解主要由蛋白水解酶完成。基质金属蛋白酶(mmps)是锌依赖的细胞外蛋白水解酶,能降解基底膜,促进恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。mmps活性的主要调节因子是组织金属蛋白酶抑制剂(timps)。timps能与激活的mmps结合,即timp2和mmp2,它们能抑制mmps的产生和活性。timps是肿瘤恶性和转移的抑制剂。陈雷锋等研究证实,mmp2在原发性肝癌细胞中的表达减少可以抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。王文祥等实验结果表明,tmip2的表达与非小细胞肺癌的淋巴结转移呈负相关,即tmip2在有淋巴结转移的肺癌组织中表达减弱。陆金娥等研究表明,在宫颈癌的演进过程中,细胞通过上调timp2的表达,可以抑制癌细胞的侵袭和转移。结果表明,随着rh2浓度的增加,mmp2蛋白表达下降,timp2蛋白表达增加。两者均保持相对稳定的状态,阻止细胞外基质的降解,从而抑制人结肠癌lovo细胞的迁移和转移。

E-钙黏着蛋白是一种钙依赖性跨膜糖蛋白,广泛分布在各种上皮细胞中。它除了介导胚胎组织的发育,组织的形成以及参与细胞与细胞之间信息的交换外,还主要介导同源细胞之间的粘附反应。除了其作用外,促进细胞的粘附和聚集,维持上皮形态的结构完整性,维持细胞的极性并参与分化的调节也是必不可少的。 E-钙黏着蛋白在肿瘤细胞中表达的丧失降低了细胞之间的均匀粘附,导致肿瘤易于扩散和转移。鲍俊杰等实验发现,E-钙黏着蛋白的表达从正常乳腺组织发展到乳腺癌组织到腋窝转移性淋巴结组织逐渐降低。 Weng Mixia等人还表明,ECadherin的下调与非小细胞肺癌的进展,分化和转移密切相关。吴继峰等的研究结果表明,E-钙黏着蛋白的表达与肿瘤的类型和分化有关。恶性程度越高,分化越差,E-钙黏着蛋白的损失越明显。这项研究的结果表明,E-钙黏着蛋白的表达水平与Rh2的浓度呈正相关,并且还证明了Rh2在抑制人结肠癌细胞LoVo细胞迁移和转移中的作用。

--catenin主要位于细胞膜中,其主要功能是介导细胞间粘附并参与基因表达。 Li等。发现胃癌中β-catenin的低表达率与肿瘤转移有关,而E-Cadherin和β-catenin的正相关和协同作用表明它们参与了肿瘤的恶性转移。意义。在这项研究的结果中,E-钙黏着蛋白和β-连环蛋白的表达随Rh2浓度的增加而正增加,这表明Rh2抑制人结肠癌LoVo细胞迁移和转移的意义。

CD44分子作为细胞表面跨膜糖蛋白粘附分子而广泛分布。它主要参与细胞之间以及细胞与基质之间的特异性粘附过程,并且在细胞粘附,血管形成以及肿瘤侵袭和增殖中起重要作用。姚杰等。发现肺癌淋巴结转移中CD44的表达与转移性淋巴结中CD44的表达呈正相关,提示癌细胞中CD44的表达越高,淋巴结病变程度越高。转移的风险更高。在这项研究的结果中,CD44蛋白的表达水平随着Rh2药物浓度的增加而降低,这再次证实Rh2在抑制人结肠癌细胞LoVo细胞迁移和转移中的作用。

近年来,已经使用一种以上的中药或中药单体来研究其对人结肠癌细胞LoVo细胞的侵袭或转移的影响。例如,安昌勇和其他研究已证实槲皮素可用于人结肠癌细胞LoVo细胞。处理48 h后,LoVo细胞的增殖和侵袭能力受到明显抑制,半抑制剂量(IC50)值约为40μmol/L。李素云等研究证实,上海中医药大学附属医院的临床使用大剂量血清组可以有效降低LoVo细胞的侵袭性和运动能力。郭颖等的研究证实,青蒿琥酯还可以抑制大肠癌细胞的侵袭能力。但是,与人参皂苷Rh2相比,上述药物人参皂苷Rh2的剂量小,作用时间相对较快,具有明显的优势,无疑为临床结肠癌转移的治疗提供了新的方向。

总之,人参皂苷Rh2已显示出在体外抑制人结肠癌LoVo细胞迁移和转移的能力,这为临床结肠癌转移的治疗提供了基础。然而,其抑制肿瘤转移的具体机制仍有待确定。进一步的研究证实。

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