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关于大鼠羊膜细胞体外培养及其干细胞标记物的表达

来源:www.timetimetime.net 时间:2020-01-02 编辑:故事

羊膜位于胎盘绒毛膜的内侧。它是一种透明的膜,没有血管,神经,淋巴和肌肉。它可以保护胎儿,并且与胎儿发育密切相关。人羊膜细胞在受精后第8天开始形成,具有多种分化潜能。它们可以分化为三个胚层细胞。最近的研究表明,羊膜上皮细胞可以分化为成熟的神经细胞并合成和释放多巴胺。神经递质,例如乙酰胆碱和去甲肾上腺素。人羊膜细胞具有低免疫原性和有效的免疫抑制活性,并且在细胞移植后没有发生急性排斥反应。本实验从大鼠羊膜中分离出羊膜细胞,建立稳定的培养条件,并对其生物学特性进行了探讨,为今后在细胞移植治疗中的应用提供了实验依据。

1材料和方法:

1. 1种材料

1. 1. 1主要仪器:二氧化碳培养箱,净化台,倒置显微镜,倒置荧光显微镜,共聚焦荧光显微镜,流式细胞仪。

1. 1. 2种主要试剂: DMEM高葡萄糖培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基,DMEM),人表皮生长因子(EGF),0.25%含EDTA的胰蛋白酶(0.25%胰蛋白酶-EDTA),胎牛血清牛血清(FBS) ),抗生素(青霉素,链霉素)和PBS缓冲液购自Gibco。 Oct-4,Sox-2,SSEA-4,巢蛋白,波形蛋白,BDNF,NGF,CD90购自Abcam。 CD29和CD44购自eBioscience,CD45和CD11b购自BD。

1. 1. 3实验动物: SPF级SD大鼠,年龄18至18,共5天,购自中国军事科学院实验动物中心,许可证号: [SCXK-(军)2014-0004],已使用用于实验动物批准号: ILAS-PL-2014-001。在无菌条件下进行实验程序以分离羊膜组织。

1. 2种方法

1. 2. 1羊膜细胞的分离和培养向: SD妊娠大鼠腹膜内注射1%戊巴比妥钠(0. 01 mL/g),麻醉,在无菌条件下进行剖腹术,子宫层机械分离,胎盘剥离分离的羊膜在含有500 U/mL双抗体的PBS溶液中洗涤。将羊膜组织置于含有500 U/mL双抗体的DMEM基础培养基中,并将无菌眼科剪刀切成约1 mm3的小块。将组织悬浮液转移至50mL离心管中,以1000r/min离心5min,并丢弃上清液。加入含EDTA的0. 25%胰蛋白酶10 mL,在37°C,5%CO2下消化20至30分钟。用含有10%胎牛血清的完全培养基停止消化。通过200目不锈钢滤网过滤单细胞悬液,接种到25 cm2烧瓶中,在含有10%FBS,10μg/LEGF和500 U/mL双抗体的DMEM完全培养基中培养,每隔一天更换细胞,2至3个细胞超过培养瓶的85%至90%后,将细胞传代。

1. 2. 2流式细胞术:将细胞培养2至4代,并用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化,并用含10%FBS的DMEM完全培养基消化。将细胞计数稀释至1×106细胞,每个流管1 mL细胞悬液。向每个试管中加入2 mL PBS,以混合细胞,以2000 r/min的速度离心5分钟,并弃去上清液。重复将细胞重悬于2 mL PBS中,以2000 r/min离心5分钟,弃去上清液。每管将细胞重悬于50μLPBS中,添加抗体CD29-PE-Cy7,CD44-PE,CD90-FITC,CD45-PE-CY7,CD11b-APC,并在室温下孵育30分钟。将各管重悬于2mL PBS中,并以2000r/min离心5min,并弃去上清液。将每个管重悬于300μLPBS中进行检测。

1.2.3免疫荧光染色:取2-4代细胞。0.25%的细胞被edta胰蛋白酶消化,10%的fbs-dmem被完全消化。加入完整的培养基,再次悬浮,直到在24孔培养板中培养。当细胞增殖到70%时,洗涤pbs,4%多聚甲醛(预冷)固定10分钟。PBS洗了两次,每次5毫米。1%tuiton-100x孵育10分钟。PBS洗了两次,每次5毫米。山羊血清工作液在室温下密封30分钟,每孔100μL。抽吸山羊血清工作液。抗体oct-4(1:200)、sox-2(1:200)、ssea-4(1:200)、nestin(1:100)和vimentin(1:100)用抗体稀释液稀释,4℃孵育过夜。PBS冲洗3次,每次5分钟。在黑暗条件下,pbs稀释fitc标记的羊抗鼠抗体(1:200),37℃孵育30min。PBS冲洗3次,每次5分钟。达皮密封片。共焦荧光显微镜。

1.3统计学方法实验结果用x-s表示,spss 15.0统计软件处理,单因素方差分析和lsd检验,p<;0.05有显著性差异。

2个结果

2.1分离培养大鼠羊膜细胞。显微镜下,细胞像变形虫一样生长(图1a)并且生长迅速(图1b),这需要每隔一天进行一次液体交换。在本实验中,大鼠羊膜细胞可以移植到6-7代。

2.通过流式细胞仪鉴定了大鼠羊膜间充质细胞表面标记的6%和95.8%。细胞表面抗原CD90和CD45几乎不表达,而CD11b则少量表达(图2,参见颜色插入6)。

2. 3细胞表面标记结果的细胞免疫荧光鉴定在本实验中,大鼠羊膜细胞通过干细胞标记Oct-4和Sox-2通过细胞免疫荧光表达(图3),神经干细胞标记nestin和间充质表达。干细胞标记波形蛋白(图4)(图3-4)和胚胎干细胞标记SSEA-4(图5)。它可以表达神经营养因子BDNF和NGF(图6)(图5-6)。

3讨论

细胞免疫荧光实验表明,大鼠羊膜细胞表达干细胞表面标志物Oct-4和Sox-2,间充质细胞标志物波形蛋白和神经元标志物巢蛋白,它们表达SSEA-4。它可以表达神经营养蛋白标志物BDNF和NGF,这是神经元生长和存活所必需的蛋白质分子。羊膜细胞表达间充质干细胞标志物CD29和CD44,其表达水平高于95%。几乎不表达CD45和CD90,而少量表达CD11-b。 Oct-4可以参与胚胎干细胞的自我更新,并调节胚胎干细胞的多分化潜能。研究表明,Oct-4可以在羊膜细胞的细胞核和细胞质中表达。 Miki等。结果表明,人羊膜上皮细胞和间充质细胞可以表达干细胞标志物,例如Sox-2和Oct-4。该实验的结果表明,Oct-4在大鼠羊膜细胞的细胞核和细胞质中均表达。巢蛋白被认为是胚胎和成年组织中多能神经干细胞的标志物。它在有丝分裂活跃的中枢神经系统和周围神经系统细胞中表达,现在被广泛用作神经干细胞的标志物。人羊膜来源的间充质干细胞分化为神经样细胞并表达巢蛋白,Oct-4和Sox-2。波形蛋白的作用是维持细胞形态,细胞质完整性和稳定细胞骨架。研究发现,在妊娠15天时即可在大鼠胚胎中检测到巢蛋白和波形蛋白的表达,而巢蛋白和波形蛋白也在人羊膜细胞未分化的前体细胞中表达。

研究发现,巢蛋白和波形蛋白因子均在羊膜细胞和人羊膜细胞中表达。 SSEA-4被认为是特定人类胚胎干细胞和卵泡胚胎早期裂解的标志物,也被认为是成人间充质干细胞的标志物。 Ilancheran等。和他的同事MIKI等。证明人类羊膜上皮细胞表达胚胎干细胞表面标记SSEA-4。在该实验中,通过细胞免疫荧光检测大鼠羊膜细胞表达巢蛋白,波形蛋白和SSEA-4。 NGF和BDNF都是神经营养蛋白家族的成员。 NGF也是一种信号分子,缺乏NGF对神经元和神经元凋亡的营养作用。 BDNF促进神经元存活并支持神经元和突触的生长。中华比较医学杂志,2015年4月,第1期。 25,No.4 Chin J Comp Med,2015年4月,第一卷。 25.第436号区分。 BDNF可以减少突触损失,纠正某些异常基因表达,预防神经元萎缩并改善与年龄有关的认知障碍,并改善学习和记忆。研究人员发现,人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质细胞可以合成并释放神经营养因子BDNF,NGF和NT-3。细胞培养未检测到其他神经营养因子。多个实验已经证实,通过将人羊膜细胞移植到受损部位以修复受损的神经,BDNF的表达水平得以提高,这表明人羊膜细胞可能通过释放BDNF来修复受损神经元的功能。在该实验中,还发现大鼠羊膜细胞通过细胞免疫荧光表达神经营养因子BDNF和NGF。

人羊膜间充质细胞表达间充质细胞标记CD29,CD44,CD73,CD90,CD166和CD105,不表达骨髓造血标记CD34和CD45,单核细胞标记CD114和巨噬细胞标记CD11b。当Murphy等人研究人羊膜上皮细胞的特性时,发现人羊膜上皮细胞表达上皮粘附分子EpCAM,而几乎不表达CD90和CD105。人羊膜间充质细胞表达CD90,CD73和CD105,它们的表达水平高于95%,而CD45和CD34的表达水平低于2%。 Bailo等人发现人羊膜细胞表达CD105,CD73,CD90和CD29,但不表达CD34,CD45,CD14和CD3 [18]。在该实验中,通过流式细胞术检测大鼠羊膜细胞表达CD29和CD44,不表达CD90和CD45,并少量表达CD11b。羊膜细胞易于分离和培养,细胞生长快,免疫原性低,具有分化为三个胚层的潜力,在相关疾病的治疗上具有良好的前景。在该实验中,系统地检测了大鼠羊膜细胞的四种干细胞标记。发现大鼠羊膜细胞可以表达干细胞表面标志物Oct-4和Sox-2,胚胎干细胞标志物SSEA-4和间充质干细胞标志物。波形蛋白和神经干细胞标志物Nestin,也表达神经生长因子BDNF和NGF。因此,我们推测大鼠羊膜细胞可能具有一定的间充质干细胞和神经干细胞特性,为相关的神经疾病基础研究和治疗提供了一些线索。

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