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IL-33scFv-IgG1Fc全人源抗融合蛋白在CHOk1细胞中稳定高表达

来源:www.timetimetime.net 时间:2019-10-21 编辑:企业

白细胞介素33(il-33)是il-1家族的一员,在多种组织和细胞中广泛表达。主要参与th2细胞型免疫反应的调节,与过敏性疾病和自身免疫性疾病有关。性。il-33抗体抑制il-33/st2通路可减轻小鼠变应性哮喘、变应性鼻炎和类风湿关节炎的症状,抑制疾病的进展,是治疗变应性和自身免疫性疾病的潜在靶点。单链抗体片段(scfv)可由完整的人源抗体库进行筛选。我们小组将预先筛选的全人类抗il-33单链抗体与人igg1-fc片段整合,构建了通用的真核表达载体。载体PCDA3.1/SP-SCFV-FC确保了抗体在源上的人源,克服了SCFV稳定性差、血清半衰期短的缺点,并恢复了Fc段功能,如抗体依赖的细胞介导的生物学效应,如细胞毒性。由于先前构建的载体表达水平较低,很难纯化蛋白质。本研究试图将重组基因sp-scfv-fc插入到真核表达载体pmh3en中以提高蛋白表达水平,这是一种大规模制备晚期scfv-fc的方法。打基础。

1材料和方法

1。1种材料

真核表达载体PMH3EN购自杭州安普生物技术有限公司。总RNA提取试剂盒和通用DNA纯化回收试剂盒购自天根。 DNA标记,DNA限制酶和连接酶,DNA聚合酶等。 ST2是从Sino Biological Inc购买的; CHO k1细胞,Topo10感受态细胞和人IL-33由四川医科大学基础医学院保存; G418购自Beyotime; LipofectamineTM 2000转染试剂和胎牛血清(胎牛血清,FBS)购自Gibco; HRP标记的山羊抗人IgG1 Fc抗体购自Abcam。

1. 2种方法

1.2.1重组载体pH3EN/SP-scFv-Fc用重组质粒pcDNA3.1/SP-scFv-Fc消化核酸内切酶HindIII和Not I,回收SP-scFv-Fc并插入质粒。在PMH3EN中,将重组质粒转化入Topo10感受态细胞,然后通过PCR鉴定并测序。

1。2。培养并转染2个cho k1细胞。cho k1细胞在dmem培养基(含10ml/l fbs)中37℃和50ml/l co 2培养。筛选g418的浓度和维持浓度。将细胞悬液置于6孔板中。当细胞生长到约80%的汇合度时,对正确的重组质粒pmh3en/sp-scfv-fc和先前构建的重组质粒pcdna3.1/sp-scfv-fc进行测序。分别用脂质体转染cho k1细胞(具体方法按说明书进行),以未转染的chok1细胞为对照。转染24小时后,对g418进行压力筛选,每3-5天更换一次。培养21天后,进行培养。

1。2。3逆转录聚合酶链反应检测igg1-fc mrna水平提取转染细胞总rna,以总rna为模板进行cdna反转录,扩增igg1-fc片段。引物为fc-f-bamhi/fc-r-noti,β-actin为内标,引物为p1/p2,未转化细胞为对照,引物序列参考文献。

1。2。4免疫印迹分析单链抗体Fc蛋白水平,提取细胞总蛋白,SDS-PAGE和电转染NC膜。阻断1h后,以hrp标记的山羊抗人igg1 fc抗体(1:5000)孵育1h,洗涤3次,化学发光,以β-actin为内标。

1. 2. 5 Western blot分析转染的CHO k1细胞上清液中scFv-Fc蛋白的含量和具有生物学活性的CHO k1细胞的生长达到85%,并换成无血清培养基。将细胞在32℃和50mL/L CO 2下培养3天,持续3天。通过蛋白质印迹检测目标蛋白在上清液中的表达。用人IL-33抗原进行SDS-PAGE并电穿孔到NC膜上。将细胞上清液中分泌的scFv-Fc用作第一抗体,并将HRP标记的山羊抗人IgG1 Fc抗体用作第二抗体,以检测转染的CHO k1细胞。分泌的scFv-Fc是否具有结合抗原IL-33和抗人IgG1 Fc的能力。

1. 2. 6筛选具有稳定高表达细胞系的细胞在G418压力筛选后,将1000个细胞接种到软琼脂培养皿中,在37°C下培养以形成宏观克隆,并挑选96个克隆并分别种植。将96孔板在37℃下培养。当细胞汇合度约为85%时,将其替换为无血清培养基。将细胞在32℃下培养3天,并从每个克隆的NC膜上取5μL培养上清液。通过斑点印迹筛选高表达细胞系。每组选择五个具有较高表达水平的单细胞系用于下一轮筛选。选择高表达的细胞系为5×105细胞/mL,并在32℃的无血清培养基中培养5至7天,并收集细胞上清液。通过ELISA确定上清液中的scFv-Fc产生,并且通过将标准人IgG稀释至不同浓度梯度来制备标准曲线,并且基于标准的标准曲线来估计scFv-Fc的产率。

1.2.7竞争elisa法检测单链抗体fc是否能抑制il-33与st2受体的结合。采用竞争elisa法检测单链抗体fc是否能抑制il-33与st2受体的结合。取96孔elisa板,50ug/ml取il-33,4c包被过夜,洗涤后密封1h。洗涤后,每50ug L分别加入20ug/ml和10ug/ml生物素化ST2。加入或不加入细胞培养上清中表达的单链抗体fc抑制il-33与st2的结合。洗涤后加入strepta抑制il-33与st2的结合。在a450处测定了livivin-hrp的吸光度值。

1.2.8采用spss17.0软件进行统计分析。数据用x+s分带表示,两组数据用单因素分析,p<;0.05有显著性差异。

2个结果

2.1 pmh3en/sp-scfv-fc重组载体的构建与鉴定

将构建的重组质粒p mh3en/sp-scfv-fc转化topo10细胞。随机选择10个克隆进行pcr鉴定(引物对sp-f-hind i i i/fc-r-not i)。5个克隆(克隆1、4、6、7、8)在1560bp处有明显的条带(图1)。克隆6被带到上海因维创公司进行测序。结果表明,插入的sp-f-scfv-not i克隆在1560bp处有明显的条带(图1)。C顺序和方向正确。

2.2确定G418的最佳筛选浓度

用不同剂量的G418培养基培养CHO k1细胞14天后,以≥418μg/mL剂量的G418培养的细胞全部死亡。 600μg/mL G418作为筛选剂量,而300μg/mL G418作为维持剂量。

2. 3重组质粒的转染与鉴定

2. 3. 1在PMH3EN/SP-scFv-Fc转染的CHO k1细胞中检测到scFv-Fc mRNA的mRNA。逆转录PCR的结果表明,转染的细胞和对照未转染的细胞为200bp。在300 bp之间的位置发现了放大的β-肌动蛋白条带;在两个转染组中,一条扩增的Fc片段的单条带出现在大约760 bp处,带有IgG1 Fc铰链区-重链恒定区2-重链恒定区3(铰链-CH2-CH3)大小相同,未转染组未显示乐队。以上结果表明两组细胞的靶基因已经成功转移。

2. 3. 2在PMH3EN/SP-scFv-Fc转染的CHO k1细胞中检测到scFv-Fc蛋白,结果显示: 3组CHO k1细胞以相对分子质量(M)出现42,000。在两个转染组中,Mr均在Mr 67 000附近出现条带,而pcDNA3.1/SP-scFv-Fc转染组中的条带较弱,未转染组中没有条带。这些结果表明scFv-Fc在两个转染组的细胞中表达,并且PMH3EN/SP-scFv-Fc转染组的表达水平显着更高。

2. 3. 3用scFv-Fc Western blot检测转染了PMH3EN/SP-scFv-Fc的CHO k1细胞的培养上清液中的scFv-Fc的表达。检测到两个转染组。在先生附近有条带。在对照未转染组中没有条带,表明scFv-Fc在两种转染细胞的细胞培养上清液中成功分泌并表达。用IL-33检测scFv-Fc在细胞上清液中的表达(本小组纯化并保存)。结果显示在: PMH3EN/SP-scFv-Fc转染组中,先生附近有1条带(pcDNA3.1/SP-scFv-在Fc转染组和对照组中未检测到条带(结果未显示) )。以上结果表明,真核表达载体pcDNA3.1和PMH3EN表达的scFv-Fc可以分泌在细胞上清液中;表达的scFv-Fc具有生物学活性,并与IL-33特异性结合。

2. 4稳定的高表达细胞株的筛选

使用斑点印迹法检测两个所选细胞系中scFv-Fc的表达。从每组中选择5个表达相对较高的细胞,并进入下一轮筛选。经过4轮筛选,Dot印迹结果表明,每个单细胞株都可以稳定表达scFv-Fc,PMH3EN组的scFv-Fc表达优于pcDNA3.1。最初确定ELISA上清液中scFv-Fc的表达约为10 mg /L。

2. 5个scFv-Fc具有抑制IL-33与ST2结合的功能

包被il-33,添加生物素化st2,是否添加il-33。用hrp标记的链霉亲和素检测生物素化st2。竞争elisa结果显示,il-33与st2受体结合良好。当同时加入st2和scfv-fc时,hrp标记的链霉亲和素的吸光度显著降低(p<;0.01),表明表达的scfv-fc能显著抑制il-33与st2的结合。

3讨论

il-33通过st2激活免疫细胞并产生各种效应分子。il-33刺激小鼠骨髓树突状细胞成熟,表达促炎细胞因子和趋化因子。促炎性细胞因子被认为是特应性疾病恶化的关键因素,尤其是il-33介导的过敏性气道炎症中哮喘的严重表型。il-33促进肥大细胞的增殖和活化,加重气道阻塞,间接增加中性粒细胞组织的浸润,促进哮喘的发展。il-33促进m2巨噬细胞极化,产生趋化因子参与气道炎症,在特发性肺纤维化中起重要作用。小鼠抗il-33抗体能显著降低香烟烟雾所致小鼠肺部炎症,减少肺泡灌洗液中巨噬细胞和中性粒细胞的数量,降低炎性细胞因子的表达,减轻过敏症状。减轻博莱霉素所致肺纤维化,减轻卵清蛋白所致过敏性鼻炎。良好小鼠过敏性哮喘气道炎症。提示il-33阻滞剂可作为治疗过敏性疾病的新药,抑制il-33的产生和活化,而中和il-33抗体的药物具有广阔的应用前景。

在先前的研究文献中,用于中和IL-33的抗体是鼠。这些抗体通常仅用于动物实验。它们易于在人体内产生人抗小鼠抗体,半衰期短,并可用于重复的超敏反应。这项研究的scFv源自我们实验室中建立的完全由人衍生的抗体库。 IgG1 Fc片段(铰链区,重链恒定区2和重链恒定区3)来自健康的成年单核细胞,避免了抗体来源。异质性问题。抗体药物表达细胞通常选择接近人类细胞的哺乳动物细胞,从而允许蛋白质组分的翻译后修饰接近人类,而CHO细胞是市场上使用最广泛的细胞。 CHO细胞具有内源性蛋白质分泌少和蛋白质活性高的优点。在这项研究中,表达的蛋白scFv-Fc可以在细胞上清液中分泌,这种分泌的表达可以促进目标蛋白的纯化,但是外源蛋白的分泌表达通常具有表达低的缺点,这就是抗体产业发展的关键。一。

在本研究中,我们构建了两种不同的载体来筛选稳定的高表达细胞系,以提高蛋白质的表达量。pmh3en载体组在细胞培养上清中分泌的目的蛋白scfv-fc相对高于pcdna3.1载体组。在细胞筛选过程中,软琼脂克隆比常用的稀释克隆操作更方便,筛选效果更好。经过4轮筛选,获得了表达水平较高的稳定细胞系,经初步检测可达到表达量。10mg/L,是少量表达的初步表达,与文献[21]所描述的(1~5)g/L有很大不同,悬浮培养的表达条件需要在后期进行优化。获得了较高的表达效率。本研究所表达的单链抗体fc与山羊抗人igg1-fc结合,并具有特异性结合人il-33的能力,显著抑制了il-33与st2受体的结合。scfv-fc能否用于治疗过敏性疾病还需要进一步的评价。

下一步:microrna对周围神经再生的调节

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