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低分子量鱼精蛋白介导的天花粉蛋白的抗肿瘤实践

来源:www.timetimetime.net 时间:2019-10-14 编辑:经典语录

中药天花粉是毛癣菌或双侧蝎罗氏刺Har的根。它具有清除热量,减少肿胀和脓性分泌物的作用。它主要用于发烧,烦渴,肺热和干咳。天花粉蛋白(TCS)是天花粉蛋白的主要活性成分,具有多种生物学活性,最引人注目的是其抗肿瘤活性。研究表明天花粉蛋白适合胃癌,宫颈癌,乳腺癌,肺癌等。肿瘤细胞具有明显的抑制作用。它通过灭活肿瘤核糖体来抑制蛋白质合成,从而杀死肿瘤细胞。然而,由于细胞膜的存在,只有少量脂溶性,非极性或不带电荷的小分子可以在整个膜上自由扩散,并且大多数生物大分子药物,例如蛋白质,都难以渗透。细胞膜,不能进入细胞发挥治疗作用。这将限制TCS的推广和应用。穿透肽是一种富含精氨酸的肽。作为药物载体,它可以有效地将各种外源大分子(例如肽,蛋白质,核酸,甚至纳米粒子)带入细胞,而不会影响环境。承载“货物”的生物活性。因此,我们的研究团队通过蛋白质重组技术构建了TCS表达系统,并在其C末端引入了半胱氨酸作为修饰位点,并将其与细胞穿透肽低分子量鱼精蛋白(低分子)化学偶联。重量鱼精蛋白,LMWP)通过二硫键实现固定点。 LMWP介导的转运增强了TCS进入肿瘤细胞的能力,并且肿瘤内的还原性环境可以裂解二硫键并在固定点释放药物,从而增强TCS的抗肿瘤作用,如下所述。

1材料与方法

1. 1细胞和菌株E. coli BL21(DE3)保存在我们的实验室中。质粒由上海杰瑞生物工程有限公司构建。细胞为人乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌HeLa细胞,购自中国科学院上海细胞银行。

1.2药物和试剂:二甲基甲酰胺(DMF),二甲基亚砜(DMSO),氯化钾,磷酸二氢钠,磷酸氢钾,三羟甲基氨基甲烷,十二烷基硫酸钠(SDS),乙二胺四乙酸二钠(EDTA),巯基乙醇(β-ME) ,过硫酸铵,甘氨酸,琼脂粉,三乙胺,浓盐酸,氯化物。钠和咪唑(中国医药集团化学试剂有限公司);蛋白ept,酵母提取物(英国Oxoid公司); 3-(2-吡啶基二巯基丙酸)N-羟基琥珀酰亚胺丙酸酯(SPDP),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(美国Thermo公司); BCA(次戊二酸)蛋白质浓度测定试剂盒,青霉素链霉素双抗体(P-S双抗体),卡那霉素,四甲基乙二胺,胰蛋白酶消化液(上海碧云天生物技术研究院); Ellman试剂(上海沃凯生物技术有限公司);异硫氰酸荧光素(FITC,探索生物技术有限公司);四甲基唑盐(MTT)(美国Sigma-Aldrich公司); 1640细胞培养基,澳大利亚血胎牛血清(美国,Gibco公司);实验用水是超纯水,其他试剂是分析纯。

1。3台主要仪器:Ni2+-NTA亲和层析树脂(美国诺华根);PWVF纯水仪,HF90细胞培养箱(美国Heal Force);IX81倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯);LDZX-50KBS高温高压灭菌器(上海申安医疗器械);微孔膜(美国Millipore);多功能X1R低温高速离心机(美国Thermo);纯化器UPC快速蛋白液相色谱(FPLC)、肝素Pro和柱(美国通用电气公司);BT25S电子天平(德国Sedore Scientifics Instruments);Lab850酸度计(肖特,德国);THZ-D台式恒温振荡器(苏州培英实验设备有限公司);Geldoc XR凝胶成像系统,小型蛋白聚糖电泳仪(BOLE,美国);JY92-IIN超声细胞破碎机(宁波新志生物技术有限公司)有限公司)。

1. 4 TCS重组蛋白的构建和表达TCS质粒是由美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因序列数据库构建的,在其3'末端插入了10个天冬酰胺和一半作为模板。胱氨酸编码该序列,该突变体被命名为TCS-10N-C。测序后,将TCS和TCS-10N-C质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,并在含有50μg/mL卡那霉素的固体培养基中培养过夜。第二天,挑选阳性克隆并接种到1 mL LB培养基(含卡那霉素50μg/mL)中,在37°C摇动至600 nm的吸光度(D值)为0.60.8左右。将1:100转移到新的LB培养基中,在37°C的振点下将培养物的D值扩展至600 nm,大约为0.60.8。加入IPTG至终浓度为10mmol/L,并在室温下诱导表达8小时。细菌在8000 r/min和4°C下离心。最后,将细菌溶液用洗涤缓冲液(20 mmol/L NaH 2 PO 4,50 mmol/L NaCl,pH 7.4)稀释至原始溶液的4%中等音量。

1. 5重组蛋白的纯化将诱导的大肠杆菌置于-80°C的超低温冰箱中,反复冷冻和融化3次。然后,将冰浴探针超声破碎90分钟,最后以8000r/min和4℃离心30分钟,并取上清液。用Ni2 + -NTA树脂纯化重组蛋白。首先添加5柱体积的上清液,然后用5柱体积的Wash缓冲液洗脱非特异性吸附的蛋白质,并继续用5柱体积的50 mmol/L咪唑缓冲液(洗涤缓冲液,50 mmol/L咪唑)洗脱。pH 7.4)洗脱低吸附蛋白,并用5倍柱体积的500 mmol/L咪唑缓冲液(洗涤缓冲液,500 mmol/L咪唑,pH 7.4)洗脱目标蛋白,并将目标蛋白保存在4°C。最后,用5倍柱体积的1 mol/L咪唑缓冲液(洗涤缓冲液,1 mol/L咪唑,pH 7.4)洗脱所有蛋白质再生柱,并用5柱体积的洗涤缓冲液(体积分数为20%)洗脱咪唑。乙醇储存在4°C。目标蛋白质用10体积的超纯水稀释,通过0.45μm微孔膜,并通过快速蛋白质收集器(FPLC)纯化,并使用肝素亲和柱进行分离。分离条件:A相(20 mmol/L NaH2PO4,1 mmol/L EDTA,pH 7.2),B相(20 mmol/L NaH2PO4,1 mmol/L EDTA,2 mol/L NaCl,pH 7.2)。以0.5 mL/min的流速进样,然后以1 mL/min,100%A相,1 mL/min流速和0-10%B相的流速将基线调平以进行线性洗脱。收集电导率为18 ms/cm的紫外线吸收峰,并将其存储在4 C中。为SDS-P取适量的蛋白质。通过凝胶电泳鉴定年龄。通过Ellman试剂测定TCS-10N-C。

1. 6低分子量鱼精蛋白活化酯(LMWP-PDP)的制备摩尔比为1:5:2.5。称重LMWP,SPDP和三乙胺,溶于1 mL DMF中,避免在室温下反应。 H。反应后,通过加入10体积的超纯水终止反应,以8000r/min离心20min,并使上清液通过0.45μm的微孔膜并通过FPLC纯化。有关装载条件,请参阅第1.5项。加载后,以1%/min的流速用100%A相平整基线,并用0%至100%B相线性洗脱,以70ms/cm的电导率收集UV吸收。峰。收集样品后,使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对其进行测量。

1. 7天花粉蛋白-低分子鱼精蛋白复合物(TCS-10N-SS-LMWP,TSSL)的制备和纯化在TCS-10N-C溶液中,加入TCS LMWP-PDP摩尔量的8倍。在4℃下摇动反应12小时。反应后,加入10倍体积的超纯水进行稀释,按照1.6的方法进行纯化,收集以约70ms/cm的电导率出现的紫外线吸收峰。使用超滤管浓缩收集的样品,浓缩至原始体积的1/10,然后加入9体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,并重复3次以PBS代替溶剂。通过SDS-PAGE检测得到的蛋白质。

1. 8还原性物质的响应性取2份等量的TSSL,将1份添加到5×含5%巯基乙醇的上样缓冲液中,1份是5×不含巯基乙醇的上样缓冲液,沸水为10分钟。之后,进行SDS-PAGE识别。

1. 9蛋白质FITC标记FITC以1 mg/mL的浓度溶于DMSO。将FITC以蛋白质:FITC=1:10的摩尔比缓慢添加到蛋白质溶液中,并在轻轻摇动的同时与蛋白质轻轻混合,并在黑暗中于4°C反应8 h。加入5 mol/L甘氨酸至终浓度50 mmol/L,并在4°C终止反应2 h。通过Sephadex G 50凝胶纯化除去游离的荧光素,以制备FITC-TCS和FITC-TSSL,将其保存在4°C下。

1. 10细胞摄取实验用2.5 g/L胰蛋白酶消化对数生长期的MCF-7和HeLa细胞,用新鲜培养基稀释至一定浓度,并吸收一定量的消化良好的细胞。将24孔培养板设置为在每个孔中具有约10×104 /孔的细胞密度。细胞培养箱的条件为37℃,体积分数为5%CO 2,培养时间为24h。将FITC-TCS和FITC-TSSL在1640培养基中以3μmol/L的相同浓度稀释。吸出细胞培养基,加入500μL含药物的培养基,并在培养箱中孵育4小时。吸出培养基,将其在500μLPBS中浸泡5分钟,吸出PBS,添加PBS,并将反应重复3次。最后,留下200μL的PBS,并在荧光显微镜下观察细胞的形态和荧光强度。

1.将11个处于对数生长期的MCF-7和HeLa细胞接种到96孔培养板中,细胞浓度调整为5×104/mL。将TCS和TSSL添加至培养板,并且最终浓度为400、200、100、50、25、6.25、3.12、1.06、0ug/mL。每个浓度包含六个化合物孔,并孵育48小时。 48小时后,除去培养基,并添加10μL的90μL1640培养基和5g/L MTT溶液。温育4小时后,除去培养基,加入100μLDMSO,在无光下摇动15分钟。通过酶标记测量490nm波长下的D值。各组的抑制率计算如下:P细胞抑制率(%)=(D对照组-D实验组)/D对照组×100%。使用统计软件SPSS计算半抑制浓度(IC50)。

2个结果

2. 1 TCS重组蛋白的制备通过蛋白重组技术将TCS和TCS-10N-C克隆到载体中并转化到大肠杆菌BL21中,TCS和TCS-10N-C在宿主菌中大量表达。通过Ni2 + -NTA亲和色谱柱进一步纯化肝素亲和柱后,以18 ms/cm的电导率洗脱TCS和TCS-10N-C,如图1所示。图2显示蛋白条带均匀且较少被SDS-PAGE污染。 TCS的分子量约为27 kD,与理论分子量一致。由于TCS-10N-C比TCS多10个天冬酰胺和半胱氨酸,因此分子量比TCS大约12 kD。 10N充当间隔物,促进半胱氨酸暴露于蛋白质表面,从而促进下一次化学偶联反应。

2. 2 TSSL的制备TSSL的制备原理是,LMWP氨基与SPDP琥珀酰亚胺酯反应制得LMWP-PDP。由于LMWP在280 nm的UV检测器下没有强吸收峰,因此LMWP-PDP在70 ms/cm处有很强的吸收峰,这表明LMWP-PDP已成功制备。 LMWP-PDP与TCS-10N-C偶联,并通过肝素色谱法纯化,以收集目标蛋白质,如图4-B所示。通过SDSPAGE检测获得的TSSL。如图5所示,TSSL的纯度高。尽管无法除去少量的TCS-10N-C,但纯度足以用于下一个实验。

2.3通过SDS-PAGE鉴定TSSL的还原敏感性。在巯基乙醇的作用下,TSSL的二硫键被打开并还原为TCS-10N-C。 TSSL的分子量下降,谱带下降。可以推断,在肿瘤的还原环境中可以减少TSSL,从而释放出TCS。但是,没有巯基乙醇的TSSL并没有减少,因此除了未除去的TCS-10N-C以外,大多数带都是TSSL,这与电泳结果一致。

2.4肿瘤细胞HeLa和MCF-7对药物的吸收情况如下所示。摄取HeLa和MCF-74h后,TSSL组出现绿色荧光(图7-D,H),而TSSL组的绿色荧光要强于TCS组(图7-B,F),表明LMWP的易位可提高癌细胞对TCS的吸收效率。

2. 5图8和9中的药物表明,LMWP修饰后,TCS-10N-SS-LMWP对HeLa和MCF-7肿瘤细胞的抑制作用呈剂量依赖性大大增加。随着药物浓度的增加,细胞生长的抑制率逐渐增加。在HeLa细胞中,TCS和TSSL的IC50分别为615.06和103.16 ug/mL,而MCF-7细胞的IC50分别为282.87和32.72 ug/mL。两种细胞的杀伤力提高了6倍以上,表明LMWP的有效运行可以大大提高TCS的抗肿瘤作用。

3讨论

早在两千年前的《神农本草经》,就有关于天花粉“苦味,苦寒,主要口渴,热,热”的影响,以及明代天花粉的来源和特性的记录[0x9A8B ]讨论并总结出天花粉的功效:“通过月球水,无法治愈衣服”。前几代人的临床经验证明天花粉蛋白甜,微苦,微寒,并且属于肺和胃。它具有清除热量和液体,减少肿胀和排泄,以及清热,口渴,口渴,黄疸,肺干咯血,痰肿,痰的作用。

从天花粉蛋白中分离得到的TCS已被证明是该药物的主要活性成分,已被广泛使用。许多研究结果也已经成功地应用于临床实践。 TCS是一种碱性(pH 9.4)单链蛋白,分子量为27 kDa,具有RNA-N-糖苷酶活性,可水解真核生物核糖体28S rRNA的4324位的腺苷NC糖苷键。一种腺嘌呤碱基通过不可逆地灭活核糖体来抑制蛋白质合成。研究表明:TCS具有很强的抗肿瘤活性,可以诱导HeLa细胞的形态变化,包括微绒毛消失,细胞膜起泡,染色质凝集,凋亡小体形成,DNA阶梯。 TCS对细胞增殖机制和细胞的抑制作用循环S期停滞与诱导细胞中caspase凋亡途径的激活有关。同样,TCS还可以抑制MCF-7细胞的增殖,阻断细胞的S期并激活caspase-8,9途径,从而消散线粒体膜电位并引起细胞凋亡,从而有效抑制实体瘤的生长。 TCS通过介导细胞核糖体失活发挥抗肿瘤作用。细胞内TCS的浓度与TCS的细胞毒性有关。因此,TCS对不同肿瘤细胞的致死性可能与细胞的内在化机制有关。根据相关研究,蛋白药物可以有效提高跨膜肽修饰后的细胞摄取率和杀伤肿瘤的效果。例如,LMWP,反转录调节蛋白(TAT肽)和gelonin可以连接。有效降低了疫霉菌蛋白的IC50,大大提高了该药的生物活性。研究结果表明,TCS和TCS-10N-C可以通过蛋白重组技术成功表达,TCS-10N-C通过交联剂SPDP与LMWP连接。跨膜肽修饰后,由于LMWP的作用,它被带入细胞,而TCS-10N-SS-LMWP的二硫键被肿瘤细胞中大量的还原性物质(如谷胱甘肽)打开并在定点。 TCS增加了细胞内TCS的浓度,大大增强了TCS对HeLa和MCF-7细胞的杀伤作用。

因此,本研究利用蛋白重组技术和化学偶联技术使TCS与LMWP进行定点连接,通过LMWP的转运,并利用减少肿瘤的环境定点释放,增加TCS细胞的积累,提高对肿瘤的杀伤力。影响。它为中医药发展成为具有实用抗肿瘤价值的临床药物提供了新的思路和技术手段,体现了中医药与现代基因工程的有机结合,体现了中医药的先进性和科学性。

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