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CYP3A41G依赖的CYP3A4内含子10启动的真核表达载体构造

来源:www.timetimetime.net 时间:2019-10-25 编辑:经典散文

CYP3A4是CYP3A亚家族的最重要成员,占P450酶总数的30%-40%,主要分布在肝脏和肠道。它参与许多药物和外源性毒物的氧化代谢,并且可以代谢约50%的常用临床药物。研究表明,CYP3A4在人类肝脏中的表达和活性存在明显的个体差异,其中90%与遗传多态性有关。 CYP3A4 * 1G(rs)是CYP3A4内含子10中的单核苷酸多态性(SNP)。在亚洲和南非人群中,其等位基因频率超过20%。研究表明,CYP3A4 * 1G与阿托伐他汀,环孢菌素,他克莫司和芬太尼的剂量,疗效和药代动力学变化有关。 CYP3A4内含子10在HepG2细胞中具有启动子活性,并受CYP3A4 * 1G等位基因的调控,但是CYP3A4 * 1G内含子10与CYP3A4基因表达之间的关系尚不清楚。本研究构建了被CYP3A4启动子和CYP3A4 * 1G依赖性内含子10激活的CYP3A4真核表达载体,并将其转染到HepG2细胞中,检测CYP3A4基因的表达。

1材料与方法

1.1材料

pcDNA3.1/Hygro(+)空质粒和pGEMCYP3A4由浙江大学药学院药物分析与药物代谢实验室的曾eng教授介绍。携带CYP3A4 * 1G(GG/AA)的基因组DNA来自河南汉族健康志愿者,由郑州大学基础医学院药理学系保存。质粒迷你试剂盒(Axygen),胶水回收试剂盒(Tiangen Biochemical Technology Co.Ltd.),限制性内切核酸酶(NEB),T4 DNA连接酶(TaKaRa),PrimeSTARMax DNA聚合酶,感受态DH5α和反转录试剂; TriPureIsolation试剂(Roche); SYBRSELECTMASTERMIX(Life),Invitrogenlip2000。 PCR引物由宝宝生物工程(大连)有限公司合成。设备主要包括超净工作台,PCR扩增仪,Nano-Drop2000c分光光度计,37°C摇床,离心机,水平电泳仪,ABI7500快速实时荧光定量PCR仪。

1.2质粒扩增

将pcDNA3.1/Hygro(+)空质粒和pGEM-CYP3A4质粒分别转化到DH5α感受态细胞中,并根据细胞的繁殖进行复制和扩增,然后用质粒miniprep试剂盒提取质粒。确定使用浓度。

1.3靶片段的扩增,纯化和回收根据NCBI数据库中的CYP3A4 cDNA(NM_.5)设计引物,并将EcoRV和XbaI限制位点以及保护性碱基添加到上游和下游的5'端引物。根据NCBI数据库中CYP3A4基因(AF)5'末端的上游启动子区域设计引物,并将MluI和NheI限制性酶切位点和保护性碱基分别添加到上游和下游引物的5'末端。根据CYP3A4基因(AF)内含子10的全长序列设计引物,并分别在上游和下游引物的5'端添加MluI和NheI限制性位点以及保护性碱基。 PCR引物序列示于表1。用于扩增CYP3A4 cDNA的模板是pGEM-CYP3A4质粒DNA,用于扩增CYP3A4启动子和CYP3A4内含子10的模板是人基因组DNA。 PCR反应系统: PrimeSTARMax DNA聚合酶(2×)25μL,上游和下游引物各3μL,模板DNA 4μL,超纯水50μL。反应条件为98℃10s,65℃15s,72℃2min,30个循环。将PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳后,按照凝胶回收试剂盒的说明进行操作,回收目标片段并测定浓度。

1.4pcDNA3.1-3A4重组质粒的构建

用EcoRV和XbaI消化质粒pcDNA3.1/Hygro(+)和PCR产物CYP3A4 cDNA片段,通过纯化和回收确定DNA浓度,并在16°C过夜连接。将连接产物转化到DH5α感受态细胞中,并接种在含有氨苄青霉素(100 mg/L)的LB固体培养基上。根据培养板菌落的生长选择单克隆,并提取质粒DNA并通过BamHI验证。将阳性质粒pcDNA3.1-3A4发送至Lifei Biotechnology Co.Ltd。进行测序。

由cyp3a4内含子10启动的1.5cyp3a4启动子和cyp3a4*1g依赖性真核表达载体的构建

用mlui和nhei消化重组质粒pcdna3.1-3a4、pcr产物cyp3a4启动子和内含子10的dna片段,纯化并回收dna浓度,在16℃下连夜连接,然后转化、筛选和提取质粒。用mlui和nhei双酶切质粒dna。将阳性质粒pcdna3.1-p3a4(cyp3a4启动子重组质粒)、pcdna3.1-w3a4(cyp3a4内含子10野生型重组质粒)和pcdna3.1-m3a4(cyp3a4内含子10突变重组质粒)分别送至菲律宾生物技术有限公司进行测序。测序结果与dnaman软件的预期序列一致。

1.6重组质粒转染细胞中cyp3a4 mrna的检测

将1.5法构建的3种质粒和空质粒pcdna3.1/hygro(+)分别转染hepg2细胞。48h后采集细胞,实时荧光定量pcr检测cyp3a4 mrna的表达水平。以gapdh为内参照,用δct法计算cyp3a4 mrna的表达水平。

1.7统计

数据用spss21.0软件进行统计分析。用单因素方差分析和lsd-t法比较四组cyp3a4 mrna的表达水平。试验水平为α=0.05。

2个结果

2.1构建的重组质粒的鉴定重组质粒pcDNA3.1-3A4的BamHI消化结果如图2所示,目标条带在500 bp至750 bp之间。用MluI和NheI消化重组质粒pcDNA3.1-P3A4,pcDNA3.1-W3A4,pcDNA3.1-M3A4,靶条带在1000bp至2000bp之间。消化的结果与预期的片段长度一致。测序结果均正确。

2.2转染细胞中CYP3A4 mRNA表达水平的比较表2显示了四种重组质粒转染的HepG2细胞中CYP3A4 mRNA表达水平的测定结果。

3讨论

启动子通常位于基因的上游,并且能够与RNA聚合酶特异性结合以启动转录。研究发现,一个基因的表达可以同时被多个启动子调控,不同启动子的转录效率不同。一些研究报告说,一些内含子具有启动子活性,并且可以调节基因表达。在研究小组的早期阶段,荧光素酶报告基因研究发现CYP3A4基因与药物代谢密切相关,除5'启动子外,其内含子10还具有启动子功能,并具有CYP3A4 * 1G等位基因。相依为命。基因表达通常受许多因素影响。 cDNA重组质粒的构建及其在细胞转染中的应用可以排除其他调控序列对靶基因表达的干扰,从而有效地验证DNA片段或SNP对靶基因表达的影响。已有文献报道内含子被嵌入真核表达载体中,其功能可以通过测量外源基因的表达来研究。为了测试CYP3A4内含子10是否对CYP3A4基因表达有影响,构建了一系列真核表达载体。

重组质粒中的目标片段是否正确连接到载体中需要测序验证。细菌液体PCR或酶消化的测序通常在测序之前进行。细菌液PCR在初始筛选过程中更方便,更经济,但可能会进行非特异性扩增,从而导致假阳性,这不如酶消化结果可靠。该研究使用酶消化进行验证。值得注意的是,在完成pcDNA3.1-3A4重组质粒的构建之后,在XbaI切割位点的5'末端插入了两个碱基GA以形成GATC序列,该序列被Dam甲基化酶识别。甲基在腺嘌呤N6位置引入,导致切割受阻,形成假阴性。为此,在实验中进行了BamHI单酶消化验证。由于pcDNA3.1/Hygro(+)空质粒和CYP3A4 cDNA均具有BamHI限制性酶切位点,因此将CYP3A4 cDNA插入EcoRV-XbaI,它们之间的距离为686 bp。用BamHI消化后,电泳显示消化结果在500bp之间。阳性(750 bp)。

细胞转染实验结果表明,CYP3A4内含子10能有效启动CYP3A4基因的表达,并且存在CYP3A4 * 1G等位基因依赖性,CYP3A4 * 1G突变体(AA)启动子活性低于野生型(GG)。

总之,本研究成功构建了由CYP3A4启动子和CYP3A4 * 1G依赖型CYP3A4内含子10启动的CYP3A4真核表达载体,并进一步在细胞水平上证实了CYP3A4 * 1G依赖型内含子10可以启动CYP3A4 mRNA。该表达为研究CYP3A4内含子10和CYP3A4 * 1G的功能和机理奠定了基础,并为从内含子基因调控的角度阐明CYP3A4酶活性的个体差异提供了新的理论基础。

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