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a型流感嗜血杆菌结合物游离多糖含量测定方法研究

来源:www.timetimetime.net 时间:2019-11-03 编辑:企业

流感嗜血杆菌包括嗜血流感嗜血杆菌和不可分型的流感嗜血杆菌,其中根据荚膜多糖的结构将嗜血嗜血杆菌进一步分为α至f6血清型。在所有接种了b型流感嗜血杆菌(Hib)的国家中,侵袭性Hib疾病的发生率降低了90%以上,并且Hia的发生率显着增加。 Hia与Hib病相似,具有高死亡率和严重后遗症。目前,Hia在北美人口中的发病率是世界上最高的。从1988年到2003年,美国西南部5岁以下儿童的平均年发病率为20.2/100,000。从2003年到2011年,美国阿拉斯加爆发了两次侵袭性Hia疾病。借鉴Hib多糖蛋白结合疫苗的成功经验,一些学者认为迫切需要制备Hia结合疫苗。

结合疫苗中游离多糖的含量是质量控制的重要指标之一。研究表明,缀合物的游离多糖含量与其免疫原性密切相关。当游离多糖含量超过10%时,缀合物的免疫原性降低。需要对结合物中游离多糖含量进行准确定量。

载体蛋白在结合疫苗结合化学的选择中起重要作用。载体蛋白的羧基可以在结合过程中用作结合位点,而氨基也可以被选作结合位点。对于TT,甲醛的解毒过程中一定数量的氨基被封闭,反应不易控制,导致不同批次的TT的氨基含量差异很大。在某些情况下,可以将载体蛋白衍生化,包括ADH衍生化,以获得更具活性的硫醇基团。它也可以用琥珀酸酐和连接在氨基上的琥珀酸基团衍生化,以减少结合反应过程中的蛋白质聚合。不同类型载体蛋白的表面电荷分布差异很大,这导致制备的结合物的电荷分布差异很大。因此,应该探索一种确定适合于不同电荷分布的结合物的游离多糖含量的方法。本实验建立了硫酸钠(NaDC)盐酸法与芴酮硫酸法相结合的方法来检测破伤风类毒素(TT),TTADH衍生物(TTH的衍生物,TTAH),TT琥珀酰化衍生物(succinicanhydridederi)-vativeofTT,TTSA)由三种带不同电荷的载体制备的Hia缀合物的游离多糖含量。

1材料与方法

1.1样品HIA多糖降解产物[解聚多糖(De-PS),批号:试验De-],HIA多糖衍生物[多糖降解产物ADH衍生物(AdH衍生物De-PS,De-PSAH),批号:试验HD-],TT(批号:试验HP-),TTAH(批号编号:test hd-,ttsa(批号:test hd-2015-)由公司第一实验室制备,其中hia产生菌hk643由丹麦奥胡斯大学kilian教授介绍。本实验所用的ttah和ttsa均由tt(测试hp-)制备。衍生物和共轭物由该公司的第一个实验室制备。多糖衍生物:多糖降解物被cdap活化,并与adh一端的巯基结合;结合物(2015-和):edac缩合多糖衍生物的肟碱通过共价结合tt或ttsa的羧基制备;结合物(2015和):多糖降解产物激活后,通过共价结合TT或TTAH激活CDAP。

1.2主要试剂葡萄糖、芴酮、NADC购自美国西格玛;盐酸、硫酸购自白良良友化学试剂有限公司。

1.3蛋白质含量的测定《中国药典》三(2010版)洛瑞法测定蛋白质含量。

1.4多糖含量的测定参照《中国药典》3(2010版)蒽酮-硫酸法测定多糖含量。

1.5游离多糖含量的检测采用NaDC盐酸法进行,具体参考]。向1 ml待测样品中添加100μl1%NaDC(pH 7.3),摇动混合,并在28°C下放置30分钟;加入50μl1 mol/L HCl,摇匀,在4°C离心30分钟;取1ml上清液。上清液的多糖含量通过吲哚酮硫酸法测定。

测定1.6Hia结合物游离多糖含量的方法的建立

1.6.1 NaDC盐酸法对吲哚啉酮硫酸法测定多糖含量的影响将葡萄糖标准液配制为0、10、20、30、40、50μg/ml浓度,并根据1.4方法进行测试,绘制标准曲线1。系数(r2)。葡萄糖标准品配制为0、11.5、23、34.5、46、57.5μg/ml浓度,并根据1.5方法进行测试。此时,葡萄糖标准液的最终浓度与标准曲线1一致,并绘制曲线2以计算r2。

1.6.2用NaDC盐酸法测定TT,TTAH和TTSA的最大容量将TT溶液稀释至50、100、150、200、300、400、500、600和700μg/ml,并稀释TTAH溶液稀释至50、100、150、200、250、300、350、400和500μg/ml后,将TTSA溶液稀释至50、100、150、200、250、300、400、500、600和700μg/ml 1.5处理,使用1.3项方法分别测定上清液和总蛋白含量,并通过下式计算蛋白沉淀效率。

1.6.3确定最佳离子浓度,制备多糖降解产物与TT或TTAH的混合物A和B,多糖衍生物与TT或TTSA的混合物C和D,多糖与蛋白质的质量比为1:1 。混合物,de-PS和de-PSAH溶液的最终浓度分别为0、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0和1.2 mol/L NaCl溶液。多糖的浓度为60ug/ml。根据1.5种方法,测定de-PS或de-PSAH上清液中的多糖含量,以及经NaDC盐酸处理的混合物,计算多糖的回收率,并确定最佳的氯化钠离子强度。

1.6.4确定多糖与蛋白质的最小质量比可调节上述四种混合物中多糖与蛋白质的比,并将其置于0.6 mol/L NaCl溶液中。多糖的浓度为60 ug/ml,多糖A,C和D与蛋白质的比例为1:2、1:3、1:4和1:5,多糖B与蛋白质的比例为1:2 ,1:5。 3和1:4。按照1.5法测定混合物上清液中的多糖含量,计算多糖的回收率,确定多糖与蛋白质的最小比例。

1.7 Hia结合物游离多糖含量测定方法的验证

1.7.1准确性参考方法通过添加回收率测试或Spike测试来验证游离多糖测定的准确性。在最终浓度为0.6mol/L NaCl的离子强度下,将不同浓度的de-PSAH添加到缀合物(和批次)中,并将不同浓度的de-PS添加到缀合物(和批次)中。多糖的浓度为6、12、35和56ug/ml,相应的葡萄糖含量分别为2.59、5.17、15.1和24.1ug/ml。根据1.5方法,测定多糖的回收率。

1.7.2精密度按照1.5的方法在0.6 mol/L NaCl的离子强度下测定结合物(-002和批)的游离多糖含量,每天测量6次。

2个结果

2.1 NaDC盐酸法对硫酸蒽酮法测定多糖含量的影响。当葡萄糖浓度在0-50μg/ml的范围内时,未通过NaDC处理得出的620 nm吸光度值是一致的,分别具有良好的线性和斜率。 0.和0.r2均大于0.999,这表明NaDC盐酸方法对吲哚酮硫酸法测定多糖含量几乎没有影响。

2.2 NaDC盐酸最大的沉淀TT,TTAH和TTSA的能力当TT浓度低于402.8μg/ml且TTAH浓度低于352.5μg/ml时,蛋白质的沉淀效率高于95%。当TT浓度高于497.1μg/ml和TTAH浓度高于403.6μg/ml时,蛋白质的沉淀效率低于95%。当TTSA浓度在691.0μg/ml以内时,蛋白质的沉淀效率高于95%。因此,NaDC盐酸沉淀TT,TTAH和TTSA的最大能力分别确定为402.8、352.5和691.0μg/ml。

2.3最佳方法NaDC离子浓度为盐酸de-PS或de-PSAH时,多糖的回收率约为100%,与盐浓度无关;但是,与混合物中多糖盐离子浓度的回收密切相关,在低浓度盐离子的作用下,多糖的回收率低,只有当盐离子增加到一定浓度时,才能保证回收率超过95%的多糖。当A和C的盐浓度混合物不小于0.5mol/L时,B的盐浓度混合物不小于0.6mol/L,D的盐浓度混合物不小于0.4mol/L,以因此,回收率高于95%的多糖的最佳盐离子浓度确定为0.6 mol/L。

2.4多糖与蛋白质的最小质量比当混合物A与B的质量比为1:2时,多糖降解物的回收率在95%以上。当混合物C的质量比为1:2、1:3和1:4时,多糖衍生物的回收率大于95%。当混合物D的质量比为1:2、1:3、1:4和1:5时,多糖衍生物的回收率不低于95%。

2.5方法验证

2.5.1准确性当将12、35和56μg/ml的de-PS或de-PSAH添加到这四种组合中时,添加的多糖的回收率高于90%,但是当实际添加6μg/ml时,其回收率可达5%。实际添加量为葡萄糖含量为2.59μg/ml,是标准曲线最低点的1/4。加入量相对较低,误差较大,但回收率也高于80%,表明所建立的方法对不同的组合是免费的。多糖含量的测定具有良好的准确性。

2.5.2精密游离多糖含量测定结果的CV均在10%以内,表明所建立的方法对不同组合的游离多糖含量的测定具有良好的精密度。

3讨论

nadc盐酸法测定游离多糖的理论基础是在低ph值条件下,质子化h+和nadc形成简单的nadc胶束。质子化的简单胶束可以通过酸性盐结构的强氢键作用来生长NADC初级胶束,形成更大的胶束,甚至形成凝胶HnNam(Dc)N+M沉淀,从而达到确定行程。分离多糖的目的。nadc能沉淀结合物和游离蛋白,有效分离游离多糖,然后用蒽酮-硫酸法测定上清液中游离多糖的含量。理论上,用蒽酮-硫酸法测定多糖含量时,如果有残留的nadc,也会参与反应和显色,影响检测结果。结果表明,该方法的NADC对标准葡萄糖的标准曲线无影响,也表明本实验的NADC对无HIA多糖含量的测定无影响,与姚静等的结果一致。沈健等。在本实验中,用同一批tt制备了ttah和ttsa衍生物。从衍生位点的差异来看,其羧基含量为ttsa>;tt>;ttah。实验结果表明,载体蛋白1%nadc沉淀的上限为ttsa>;tt>;ttah。因此,载体蛋白羧基含量越高,羧基含量越高。这很容易被NADC沉淀。从理论上说,在凝胶沉淀中,羧基可以与NaDC形成强氢键。因此,蛋白质的羧基数目越多,形成的氢键越强,就越容易被nadc沉淀。也就是说,在相同的实验条件下,1%nadc沉淀的上限越高。

nadc-盐酸法沉淀不同离子强度的多糖降解物

上清液中多糖及其衍生物的回收率约为100%,与盐离子浓度无关。当多糖降解剂或多糖衍生物与载体蛋白混合时,多糖的回收率随盐离子浓度的增加而增加。当盐离子达到一定浓度时,多糖降解物的回收率接近100%。在相同的离子强度下,多糖降解物或多糖衍生物与TT混合物上清液中多糖的回收率相似。说明多糖降解剂与多糖衍生物之间的电荷差对游离多糖含量的测定没有显著影响。在相同离子强度下,在TT、TTAH或TTSA与相同质量的多糖降解剂或多糖衍生物的混合物中,回收率95%所需的离子浓度为TTAH>;TT>;TTSA。多糖的回收率与蛋白质衍生方式有关。hia多糖降解产物和多糖衍生物在重复单元上均含有带负电荷的磷酸基团。样品经nadc和盐酸处理,ph值约为3.0。在此条件下,三种蛋白的正电荷由高到低依次为ttah、tt和ttsa。蛋白质的氨基含量越高,所带的正电荷越多,与多糖降解产物或多糖衍生物的结合能力越强,上清液多糖的回收率越低,所需的离子强度越高。分离。这一假设在多糖与蛋白质质量比较低的混合物中也得到了验证。

本实验通过提高离子强度来消除多糖降解产物与多糖衍生物和载体蛋白之间的相互作用,并对实验进行了系统的验证。方法快速、简便、重现性好、准确、精密。适用于不同载体蛋白制备的ha偶联物中游离多糖的测定。

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