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戊乙奎醚对内毒素致新生大鼠肠损伤时缺氧诱导因子1α及谷氨酰

来源:www.timetimetime.net 时间:2020-02-04 编辑:教育

新生儿肠损伤是儿科常见疾病之一,其主要原因包括早产、窒息引起的缺血缺氧、感染等 严重感染通常会导致危重儿童胃肠衰竭 肠道在全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征的发生和发展中起着极其重要的作用 肠道感染或局部缺血缺氧可导致肠粘膜屏障功能受损,导致细菌和内毒素移位、败血症和脓毒性休克,从而进一步加重肠组织损伤,甚至伴有远处器官受累 脂多糖作为一种典型的内毒素,可诱发内毒素血症,导致肠粘膜损伤。 国内外许多研究发现缺氧诱导因子-1α和谷氨酰胺在内毒素性肠损伤的病理变化中起重要作用 盐酸戊乙奎醚(PHC)是我国自主研发的抗胆碱能药物。 研究表明盐酸戊乙奎醚具有多器官保护作用,因为它能改善微循环,降低毛细血管壁通透性,减少溶酶体释放。 目前,盐酸戊乙奎醚对内毒素诱导的肺损伤的保护作用已被广泛证实和认识。通过大量的临床观察,我们发现盐酸戊乙奎醚在缓解肠痉挛和肠水肿方面也有很好的效果。 基于上述背景,本课题旨在研究盐酸戊乙奎醚预给药对内毒素性肠损伤新生大鼠肠组织HIF-1α和Gln表达的影响,并初步探讨盐酸戊乙奎醚的肠保护机制

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探讨盐酸戊乙奎醚预给药对内毒素致新生大鼠肠损伤中HIF-1α和Gln表达的影响及肠保护的相关机制,为临床防治新生大鼠肠损伤提供新思路。

材料和方法

1。受试者

60 SPF健康新生7日龄SD大鼠,由郑州大学河南实验动物中心提供,男、女,重18 2g

2。实验方法

2.1实验动物分组

本实验分为两部分 第一部分:将30只幼鼠随机分为3组,每组10只。 对照组(C组)、肠损伤模型组(L组)和盐酸戊乙奎醚干预组(P组)分别测定肠组织的干湿重量比,观察肠组织形态学变化,检测肠组织中细胞因子的表达。 第二部分:将30只幼鼠随机分为3组,丙组4只,丙组13只,丙组13只,观察建模后幼鼠的行为变化,计算各组24小时存活率。

2.2动物模型的制备

肠损伤模型组腹腔注射浓度为0.5毫克/毫升的内毒素(细菌脂多糖脂多糖脂多糖,大肠杆菌055: b5,西格玛公司,美国);盐酸戊乙奎醚干预组在内毒素注射前腹腔注射盐酸戊乙奎醚(成都利斯特制药有限公司,批号:)2mg/kg,制剂浓度为0.05 mg/ml 30min。对照组腹腔注射10毫升/公斤生理盐水。 在实验的第一部分,在腹腔注射内毒素或生理盐水6小时后,将大鼠麻醉并解剖。 在这两个实验中,幼鼠被放回鼠笼,并在建模完成后与母鼠一起喂养。

2.3肠组织标本采集

在密封的玻璃容器中吸入七氟醚以快速麻醉幼鼠后,将其固定在控制台上,解剖,用1毫升注射器快速从心脏采集血液,静置2小时,在4℃下以4000转/分钟离心15分钟,取上清液,并将其储存在-20℃的冰箱中进行检查 从回盲部向上3厘米处取出7厘米的回肠组织,在4℃下用生理盐水冲洗肠3次。用滤纸排出肠组织的地表水后,将7厘米的回肠组织分成4段 上1cm段用于光学显微镜下的形态学观察,中上2cm段用于测量肠组织的湿重和干重,中下2cm段用于制备肠组织匀浆,下2cm段用于逆转录聚合酶链反应检测肠组织中缺氧诱导因子-1α的表达

2.4检测指数

2.4.1计算肠组织的湿/干重量比(w/d)。

用电子衡器称量上中段2厘米回肠组织,记录湿重,然后放入70℃恒温干燥箱中48小时,直至重量不再变化,测量干重,计算干湿重量比

2.4.2肠组织的组织学观察

将1cm回肠组织置于4%多聚甲醛中检查 石蜡包埋后制作4μm病理切片,进行HE染色 在400倍光学显微镜下观察回肠组织粘膜上皮细胞的形态学变化

2.4.3采用酶联免疫吸附法测定肠组织中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、缺氧诱导因子-1α、谷氨酰胺、二胺氧化酶和血清中肿瘤坏死因子-α的含量 肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、缺氧诱导因子-1α、谷氨酰胺和二氧化硅的检测严格按照酶联免疫试剂盒(美国研发公司)的说明进行

2.4.4用逆转录聚合酶链反应方法测定肠组织中缺氧诱导因子-1α基因的表达

回肠下2厘米组织用DEPC水洗涤,然后将滤纸吸干。滤纸被液氮快速冷却并放入冷冻存储管中。将试管放入-80℃的冰箱中进行储存检查。 采用肠组织总核糖核酸提取、逆转录、核酸扩增和琼脂糖凝胶电泳检测缺氧诱导因子-1α基因在幼鼠肠组织中的表达

3。统计处理

SPSS17.0统计软件包用于统计分析。测量数据表示为平均标准偏差。使用单向方差分析进行组间比较。用LSD-t对两组进行比较。α=0.05为检验水平,P0.05为差异,具有统计学意义

结果

1。视觉观察显示,腹腔注射脂多糖后1小时内,L组和P组小鼠开始颤抖和呼吸急促。 大约2~3小时后,全身变冷,无精打采,活动能力下降,食物摄入量减少。 大约6小时后,有明显的疲倦和疲劳,几乎没有活动,没有吃东西,甚至蓝色的嘴唇。 P组幼鼠症状较轻,而C组幼鼠活动和进食正常。 丙组、丙组和丙组24小时生存率分别为100%、69.2%和92.3%。幼鼠死亡主要发生在脂多糖注射后12-24小时内。

2。与对照组相比,L组和P组肠组织湿/干重比显着增加(P005);与l组相比,p组的这一比例明显降低(P0.05) 差异有统计学意义

3.HE染色光镜结果显示,丙组回肠绒毛结构完整,上皮细胞排列有序,形态正常。L组可见绒毛细胞水肿、炎性渗出和上皮细胞紊乱。对照组绒毛水肿和炎性渗出明显减少,上皮细胞排列更加有序。

4。与对照组相比,L组和P组肠组织中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和缺氧诱导因子-1α含量升高(P005),而谷氨酰胺含量降低(P005)。与l组相比,p组肠组织中Gln含量较高(P0.05),其他指标含量较低(P0.05) 差异有统计学意义

5。与对照组相比,L组和P组肠组织中DAO含量明显降低,血清DAO含量升高(P005);与l组相比,p组肠组织中DAO含量较高,血清中DAO含量较低(P0.05) 差异有统计学意义

6。与对照组相比,缺氧诱导因子-1α基因在肠组织中的表达增加(P005);与l组相比,p组肠组织缺氧诱导因子-1α基因表达较低(P0.05) 差异有统计学意义

结论

盐酸戊乙奎醚预给药减轻幼鼠肠道水肿和炎症因子表达 其作用机制可能是盐酸戊乙奎醚通过下调缺氧诱导因子-1α的表达和维持Gln含量,降低肠道炎症反应和保护肠道黏膜屏障功能而起到肠道保护作用

关键词:盐酸戊乙奎醚;内毒素。肠损伤;缺氧诱导因子-1α;谷氨酰胺、二胺氧化酶

4.2.1抗炎和抗氧化

炎症反应是内毒素性肠损伤时的重要特征。炎症因子的瀑布级联式反应导致肠组织及循环中炎症因子的失控表达会加重器官损伤。孙梅的团队做了关于肠三叶因子(ITF)方面的研究。她们发现基因重组ITF能够下调iNOSmRNA的表达,减少NO的生成和MDA的含量,从而降低了内毒素导致的幼鼠肠组织炎症反应,对肠粘膜起了一定的保护作用[66]。另一项研究发现ITF可能通过抑制TLR4与LPS的结合从而阻止了LPS介导的细胞内信号传导,进而影响到NF-κB的入核和启动下游基因的转录,因而抑制了炎症介质的合成和释放,减轻肠粘膜损害[67]。同样地,该团队在一项研究中发现超氧化物歧化酶(SOD)在各个时相点中,LPS组的表达均低于对照组,说明了氧化损伤在LPS介导的组织损伤中起了重要作用。应用血小板活性因子受体拮抗剂银杏苦内酯B能够将SOD维持在较高水平,从而更多地清除氧自由基,减轻了LPS介导的氧化损伤[68]。另外一项近期的研究发现重要成分黄连素能预处理能够通过提高SOD和谷胱甘肽过氧化物酶的活性,降低丙二醛(MDA)和NO的水平,从而减轻LPS介导的氧化损伤。同时也能够通过下调回肠TLR4和NF-κB的表达,抑制下游炎症介质的过度产生而减轻肠组织炎症反应[69]。 国外的一项研究发现,大蒜油预处理10毫克/千克和50毫克/千克可在脂多糖刺激下降低血清sl-选择素、sICAM-1、CD11b在中性粒细胞中的表达、ICAM-1在肠内的表达以及中性粒细胞在肠组织中的浸润,从而发挥抗炎作用[70]

4.2.2肠粘膜通透性降低

肠粘膜通透性降低为内毒素进入循环提供了有利条件。炎症和氧化应激会增加肠粘膜的渗透性 因此,当肠屏障功能受损时,如何降低肠粘膜通透性,保持肠粘膜屏障的完整性尤为重要。 其中,紧密的联系起着重要的作用。 大量关于谷氨酰胺的研究已经证实,静脉或口服谷氨酰胺可以增加肠上皮细胞的抵抗力,降低肠粘膜通透性,增强肠屏障功能,并改善患者的预后[71-73] 一些研究已经报道乳铁蛋白可以增加跨上皮细胞的抵抗力并维持紧密的连接功能,从而减轻脂多糖诱导的肠粘膜屏障损伤[74] 类似地,在内毒素血症大鼠模型中,中药成分小檗碱可以下调肌球蛋白轻链激酶途径,改善肠粘膜紧密连接的损伤,降低肠粘膜通透性[75],这一机制也在另一项关于卡巴胆碱[76]的研究中得到证实

4.2.3肠上皮细胞的抗凋亡

严重内毒素血症可导致肠上皮细胞大量凋亡,这是内毒素诱导肠损伤的机制之一。 因此,抑制细胞凋亡和促进细胞增殖将有助于保护肠粘膜屏障功能的完整性。 中国的一些研究发现,肠上皮细胞凋亡的增加伴随着胱天蛋白酶-3的激活,而增殖细胞核抗原(PCNA)的表达减少([77-78),这表明此时肠上皮细胞的凋亡明显多于增殖。 这也证实了细胞凋亡在内毒素诱导的肠损伤中的重要作用。 这一观点也得到了国外研究[79]的支持,该研究发现肿瘤坏死因子受体1在脂多糖诱导的肠上皮细胞凋亡中起重要作用,该途径依赖于NF-κB2的调节。 在抗凋亡的研究中,Sukhotnik等人[80]发现Gln可以刺激肠上皮细胞的持续增殖和迁移,抑制凋亡 最近在中国的一项研究发现小檗碱还可以通过非α2肾上腺素受体依赖性途径[81抑制肠上皮细胞凋亡 还报道了双歧杆菌可以通过环氧化酶-2依赖性途径[82]抑制坏死性小肠结肠炎中肠上皮细胞的凋亡 类似地,Rho激酶抑制剂Y-可抑制新生大鼠内毒素血症期间肠上皮细胞的凋亡,并保护肠粘膜屏障功能[83]

4.2.4内毒素耐受性

内毒素耐受性是指在预先用小剂量或亚致死剂量的脂多糖刺激机体后,机体对随后的大剂量或致死剂量脂多糖[84]反应性低甚至没有反应的现象 目前,对内毒素耐受肠道保护的研究很少,其具体机制需要进一步研究和解决。 显然,内毒素预处理后的内毒素耐受性显着减少单核细胞和巨噬细胞产生促炎介质,如肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β[85] 国内研究表明,在不同时间点腹腔注射不同小剂量脂多糖后,肠粘膜ICAM-1表达下降,而sIgA表达增加,这对减少中性粒细胞粘附和聚集,从而减少炎症因子的释放,增强肠免疫屏障[85]的功能有很大益处 然而,不同的是斯蒂拉弗雷迪等人的[86]使用了240?GLPS预处理C57BL/6小鼠10~20周发现内毒素耐受抑制缺氧诱导因子-1α的表达,下游磷酸激酶1和肾上腺髓质素的表达水平也降低,耐受细胞缺氧的生存能力也明显降低。因此,内毒素耐受降低了单核细胞在缺氧条件下的存活能力和功能。 这种矛盾的原因可能是两者暴露于内毒素的时间不同,导致内毒素预刺激的效果不同。 因此,需要大量的研究来阐明内毒素耐受的信号传递机制和适当的剂量,以保证明确的器官保护作用。

5。摘要

本文对内毒素的结构、功能和在体内的转运、转归以及肠组织生理功能等方面做了概括性回顾。对败血症动物模型做了较为详细地介绍。最后对国内外一些针对内毒素血症时肠保护方面的研究在机制上做以分类总结。肠道对于人体的重要性已经不需赘述,虽然近几十年来针对内毒素性肠损伤不断有新的治疗措施出现,但其发病率和死亡率在重症患者中仍然很高。目前没有哪一种单一的药物和治疗措施能够在临床败血症的常规治疗中有效抑制炎症因子的异常释放。我们现在所得到的大量的数据都来自于动物试验,即便有些治疗措施在动物模型上有效,其仍然不能通过临床试验,更不能应用于临床。人体是一个复杂的有机体,任何病理情况的出现都会引起大量的细胞反应和分子间的相互作用。对于疾病的认识,并不是某一方面就能够解释清楚的。因此,为了更好地阐明内毒素性肠损伤的病理过程和发掘更有效的干预措施,仍需要大量科研工作者不懈的努力。

参考文献

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