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杜仲叶提取物中绿原酸的纯化及其体外抑菌效果的研究

来源:www.timetimetime.net 时间:2020-04-21 编辑:观点

摘要

本研究旨在确定杜仲叶提取物中绿原酸的纯化工艺,通过建立指纹图谱来控制产品质量,并考察其体外对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、白色葡萄球菌、乳房链球菌和乳酸链球菌的抗菌作用,为临床应用提供实验依据。 实验中采用的纯化方法是大孔吸附树脂法。首先用絮凝沉淀法对样品进行预处理,然后用高效液相色谱法建立绿原酸指纹图谱。抑菌试验主要采用滤纸法和连续梯度稀释法观察和测定其抑菌效果和最低抑菌浓度。采用紫外分光光度法和高效液相色谱法测定绿原酸的含量。

实验结果表明,絮凝沉淀的最佳工艺条件为:在10毫升pH5的样品溶液中加入1毫升1%醋酸壳聚糖溶液,在60℃水浴中搅拌4分钟,在4℃环境中放置4小时,过滤,得到高澄清度的样品溶液。实验选用NKA-树脂,最终工艺条件为:样品溶液酸碱度=4,稀释倍数=6,加载速度=2 BV/h 洗脱液为70%乙醇,洗脱速度为2 BV/h,用量为柱体积的2倍。抑菌试验结果表明,6种细菌抑菌圈直径分别为13.44毫米、18.12毫米、13.56毫米、14.00毫米、13.66毫米和13.00毫米。药液对金黄色葡萄球菌高度敏感,对其他5种细菌中度敏感。前四种细菌的最小抑制浓度为0.25克/毫升,溶液中绿原酸的含量为3.58毫克/毫升,另外两种细菌的最小抑制浓度为0.5克/毫升,溶液中绿原酸的含量为7.20毫克/毫升。最后,成功建立了杜仲叶中绿原酸的指纹图谱。通过相似性分析,其对照指纹图谱与每批样品的相似性大于0.9,表明生成的对照指纹图谱能够代表10批样品的共同特征,可作为试验方法和条件分离纯化的杜仲叶中绿原酸成分的指纹图谱。

综上所述,絮凝沉淀法和大孔吸附树脂法相结合可以有效地从杜仲叶绿原酸提取物中分离纯化绿原酸,分离出的物质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、无乳链球菌、蜡状芽孢杆菌和白色葡萄球菌具有抗菌作用

关键词:杜仲叶;绿原酸;絮凝和沉淀;大孔吸附树脂;指纹;抗菌作用

第一章文献综述

杜仲已记载于2000多年前的中国医学着作《神农本草经》[1] 在传统中医中,杜仲使用干树皮作为药物。然而,脱皮容易导致树木死亡,再加上树木生长速度有限,这两点已经成为杜仲药材资源缺乏的主要原因 因此,人们从大量废弃的杜仲叶开始,开始用叶代替皮作为药物 研究发现,杜仲叶和杜仲皮的有效成分基本相同,除了一些化学成分[2],杜仲叶中绿原酸的含量可达1-5.5%[3],明显高于杜仲皮。 绿原酸是一种脱酚酸,主要通过咖啡酸和奎尼酸的化学反应获得。 从国内外学者关于绿原酸的研究报告可知,绿原酸具有提高机体免疫功能的功能[4],还能清除体内自由基,抑制氧自由基向机体的流失[5-6] 其他研究发现绿原酸还具有降血糖、抗癌、抗病毒和抗菌作用[7-10] 可见绿原酸具有很大的药理活性,再加上高纯度绿原酸更为罕见,难怪它被称为“植物黄金”[11] 因此,如何开发利用低成本、高纯度的绿原酸具有重要意义。

1.1杜仲概述

1.1.1简介

杜仲是杜仲科的落叶乔木 16世纪,李时珍的书《本草纲目》中写道:“从前有杜仲(一个人的名字)就是这样走的,泗中和泗县都有这个意思。” 通过李时珍的介绍,让我们的后人知道杜仲这个名字的由来。

杜仲药效的描述。记载于中国第一部药物专论《神农本草经》。 后来的作品如《本草纲目》和《本草备要》描述了杜仲的药理和功效。更详细地说,如“味甘辛辣,能入肝补肾,并能使筋骨粘连” 到了20世纪中叶,包括中国、美国、日本等许多国家,通过对杜仲药理和临床应用的研究,杜仲最终被证明是天然高效的抗高血压药物[12] 20世纪80年代,开始对杜仲叶的医疗保健功能进行系统研究。通过研究发现,杜仲叶和杜仲皮的化学成分和功能相似,杜仲叶中绿原酸的含量高于杜仲皮[13-14] 此外,研究还发现杜仲叶具有较好的抗衰老、抗疲劳、抗高血压等作用

1.1.2杜仲叶的化学成分

杜仲叶含有27种木质素化合物、18种环烯醚萜类化合物、6种黄酮类化合物、16种酚类化合物、15种氨基酸和35种挥发性成分。此外,它们还含有大量维生素、微量元素、古塔胶、生物碱、多糖等。[15] 16种酚类化合物中的一种是抗癌、抗病毒、抗菌和提高免疫力的主要成分,这种成分是绿原酸。 绿原酸广泛分布于植物中。目前,绿原酸在我国大多是从金银花中分离得到的。 随着绿原酸开发利用的增加,绿原酸已从多种植物中分离出来,如杜仲叶[16、野菊花[17、烟草[18、咖啡豆[19-20等。 其中杜仲叶中绿原酸含量为0.8-2.9%[21],有文献报道杜仲叶中绿原酸含量高达1-5.5%[22] 杜仲叶中绿原酸的含量虽然不如金银花高,但其丰富的资源和低廉的价格大大提高了杜仲叶的开发利用价值。

1.2绿原酸

1.2.1绿原酸的理化性质

1897年奥斯本和坎贝尔在葵花籽中发现的一种化学物质 1909年,高尔特等人最终确认该物质为绿原酸 绿原酸的化学结构最初是由鲁德金和纳尔逊[在1947年确定的 绿原酸的分子式为C 16H 18O 9,分子量为354.30。化学结构式如图1所示

纯绿原酸的颜色为白色或黄色,为针状晶体。 绿原酸的溶解度如下,易溶于水、甲醇和丙酮,但更易溶于热水。 绿原酸稍微溶解在乙酸乙酯溶液中,但很难溶解在弱极性溶剂如氯仿中。 由于绿原酸具有缩合酚结构,其化学结构非常不稳定。 绿原酸在碱性溶液中容易变成橙色,但用稀酸溶液加热时,遇铁容易分解生成咖啡酸和黑色化合物。 绿原酸在高温和光照下容易分解,失去原有活性。因此,绿原酸应储存在低温和避光的地方。

图1绿原酸结构式

1.2.2绿原酸的生物活性

据报道,从不同植物中分离纯化的绿原酸对多种病原菌具有良好的抑制和杀灭作用。 国外学者奉和广汇等[24-25]的研究证实绿原酸具有抗菌作用 然而,国内学者王海燕和王洪军[26-27]发现绿原酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、无乳链球菌、乳腺炎链球菌等有一定的抑菌作用。通过对烟草和金银花中绿原酸抑菌作用的研究,发现这些细菌是引起奶牛乳房炎的常见菌群。 王海燕和王洪军的试验结果为治疗奶牛乳房炎的新药研发打开了大门。 此外,绿原酸对枯草芽孢杆菌、根霉、青霉、黄曲霉、黑曲霉[28-29等有一定的抑制作用 这些细菌和霉菌很容易在腐烂的食物中繁殖。研究结果为新型无污染食品防腐剂的开发提供了有价值的参考。 此外,对藤黄微球菌、痢疾志贺菌和嗜水气单胞菌[30-32]也有一定的抑制和杀灭作用

绿原酸也有一定的抗病毒作用 通过研究发现,绿原酸对猪细小病毒[33]和疱疹病毒1型[34]的感染具有一定的抑制作用,此外,绿原酸对禽流感病毒H5N1[35]和艾滋病病毒[36]的治疗具有潜在作用

(2)抗氧化性

研究发现绿原酸具有抗氧化活性 绿原酸在其化学结构中含有许多氢氧基团,使绿原酸形成具有抗氧化作用的羟基自由基。 这些具有抗氧化功能的羟基自由基用于清除羟基自由基、超氧阴离子和其他自由基,并发挥其抗氧化活性。 据报道,绿原酸具有比咖啡酸、丁香酸、生育酚和其他常见抗氧化剂更高的抗氧化能力[37]

张兴海等人[38]研究了金银花中绿原酸对猪油的抗氧化活性。结果表明,高纯度绿原酸(81%)具有较强的抗氧化活性,抗氧化能力也随着绿原酸浓度的增加而增强。 李文娜等人[39]研究了从杜仲叶中提取和分离的绿原酸的抗氧化活性。结果表明,杜仲叶中提取分离的绿原酸抗氧化活性强于绿原酸标准品 对上述测试结果的分析可能是由于杜仲叶中绿原酸提取物还含有其他化学成分,或者这些化学成分相互作用并最终发挥抗氧化活性,或者这些成分可以诱导绿原酸产生新的抗氧化成分

抗氧化剂在食品、医药和日化工业中一直占据重要地位 随着社会的发展,人们越来越重视身体健康,因此开发天然无污染抗氧化剂成为研究热点。 因此,绿原酸的这种生物活性为食品、医药和日用化学品提供了有利的参考依据。

(3)对心血管系统的影响

绿原酸抗氧化作用的生物活性绿原酸最终可以通过清除体内自由基和抗脂质过氧化作用起到保护血管内皮细胞的作用 这是绿原酸能够预防动脉粥样硬化、高血压和血栓形成等心血管疾病的主要原因。 根据Andersen等人[40]的研究结果,绿原酸可以增加钾离子浓度,降低三酰甘油、胆固醇等物质的水平,从而发挥其预防心血管疾病的作用。 我们从渡边等人的[41]中知道,从绿色咖啡豆中分离的绿原酸提取物可以降低大鼠和人类自发性高血压的血压

(4)其他生物活性

除上述生物活性外,绿原酸还具有抑制细胞突变和抗肿瘤的作用,因此绿原酸被认为是预防癌症的有效化学物质[42] 绿原酸还能刺激胆汁分泌,从而达到利胆的效果。 绿原酸还具有抗紫外线和抗辐射的作用,为防晒霜等护肤品的开发提供了参考。现在有一项欧洲专利[43]关于添加绿原酸的防晒霜。

1.2.3分离纯化方法

(1)大孔吸附树脂法

大孔吸附树脂的发展始于20世纪60年代,70年代后被广泛用于中草药的提取和分离。 大孔吸附树脂的结构包含许多大孔网络,是一种有机高分子吸附剂,因此得名。 使大孔吸附树脂起到分离作用的是其网状孔径和较大比表面积的结构特征,以及树脂的选择性作用。 因此,在分离物质时,应根据物质的特性选择不同极性的树脂,以达到分离纯化的目的。

分子的极性大小、样品的酸碱度、样品溶液的浓度和速度以及洗脱液的选择对大孔吸附树脂分离纯化中药液体有一定的影响。 熊硕等[44]最终从8种不同极性的大孔吸附树脂中选择出对杜仲叶中绿原酸具有最佳吸附分析效果的NKA-型大孔吸附树脂。通过单因素试验确定正交试验的因素和水平。最后,通过正交试验得出NKA-型大孔吸附树脂分离纯化杜仲叶中绿原酸的最佳工艺。工艺参数为:样品质量浓度4 mg/mL,样品加载速度4 BV/h,样品体积5 BV,洗脱液80%乙醇,洗脱液流速3 BV/h。

大孔吸附树脂因其物理化学性质稳定、吸附速度快、分析速度快、吸附容量大、易于再生等优点,广泛应用于食品、医药等领域。 它在中草药有效成分分离中的应用越来越受到重视。

(2)聚酰胺柱色谱

聚酰胺是一种高分子化合物,由胺基聚合形成。 聚酰胺的物理特性如下。聚酰胺由于其结构特点,不适合溶解在水、甲醇、乙醇、乙醚等有机溶剂中,在碱性条件下也是稳定的,但在酸性条件下稳定性差,因此可以溶解在浓盐酸、冰醋酸和甲酸中。 聚酰胺在其结构中含有丰富的酰胺键,而酰胺基团含有氧原子和氮原子。因此,氧和氮在酸性介质中很容易结合质子并带正电荷。它们可以与富含酚羟基的化合物如酚和酸形成氢键,并被吸附,但与不能形成氢键的化合物分离。 因此,聚酰胺在待分离物质上的吸附完成后,选择极性不同的物质作为洗脱剂洗脱吸附在聚酰胺上的物质,这是用聚酰胺分离纯化该物质的主要原理

郝凤霞等[45]应用聚酰胺方法,从金银花中分离出了绿原酸、黄酮、榭皮素和木犀草素,它们的含量分别为68.2 %、95 %、7.5 %、16.9 %。杨敏丽[46],筛选了聚酰胺柱层析法的最优的工艺参数,从金银花中分离出了纯度为70 %的绿原酸。刘军海等[47],应用聚酰胺柱层析法,从杜仲叶提取物中纯化出了绿原酸,最终得到的绿原酸纯度高达77.04 %。该方法虽然可以得到纯度很高的绿原酸,但是由于其操作比较麻烦,且产量低,洗脱时间又长,所以并不适合进行大规模的生产使用,主要是应用于分析研究中。

(3)超滤膜分离法

超滤膜分离法兴起的时间是20世纪60年代。超滤膜其实是一种选择透过性膜,它的工作原理主要是,在外力的作用下,小分子的物质可以通过滤膜,大分子的物质则不能通过滤膜,从而达到分离纯化的目的。

杨祖金等[48]研究了如何提高杜仲叶中绿原酸的转移率,试验通过对料液温度、超滤时间、膜截流量等因素的考察,最后得出的工艺参数如下:膜截留分子量为2000 00、超滤温度为40 ℃、超滤压力为0.36 MPa、时间为20 min、加水量为24 L时杜仲叶中绿原酸的转移率为99.38 %。范远景等[49]通过使用MF1-UF1-RO2膜组合来对金银花绿原酸提取液进行处理,最后得到了纯度为13.21 %以上的绿原酸溶液。超滤膜分离法虽然分离效率高且操作方便,但是其对提取液的预处理要求很高,且膜易阻塞,清理又很麻烦所以并不适用于大规模生产。

第六章 结论

6.1 絮凝沉淀法可以有效的除去杜仲叶绿原酸提取液中的部分杂质,使样品溶液达到澄清的目的。

6.2 大孔吸附树脂法,可以使杜仲叶绿原酸提取物达到纯化的目的。

6.3杜仲叶绿原酸分离提取物对金黄色葡萄球菌高度敏感,对大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、蜡样芽胞杆菌、白色葡萄球菌中度敏感。

6.4绿原酸分离物的对照指纹图谱可以作为应用本试验方法及条件分离纯化的杜仲叶中绿原酸的指纹图谱。

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