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人表皮生长因子基因重组腺病毒穿梭质粒的构建

来源:www.timetimetime.net 时间:2019-10-05 编辑:人生语录

表皮生长因子(EGF)是属于生长促进因子家族的小分子多肽。它首先由Coen博士提取到小鼠的颌下腺中,并刺激细胞外透明质酸和糖蛋白的分泌。以及细胞内DNA和蛋白质的合成,它对上皮细胞,成纤维细胞和内皮细胞具有很强的增殖作用。表皮生长因子对修复损伤有明显作用,但也有一些缺点:1伤口坏死或炎性因子会降低EGF对受损细胞的修复作用。 2生长因子不能维持伤口区域的长期有效浓度。 3需要多次使用以增加治疗费用。如果将hEGF基因导入脂肪干细胞中,使转基因干细胞能够继续分泌生长因子,并协同分化具有多向分化潜能的脂肪干细胞,则应提高伤口修复的速度。因此,本实验旨在构建含有人表皮因子基因的重组穿梭质粒,为伤口修复奠定基础。

1材料与方法

1.1质粒和试剂

pYr-ads-6腺病毒穿梭质粒购自湖南永润生物技术有限公司。T4 DNA连接酶购自日本Takara。限制酶均为MBI产物。 Taq酶,dNTP,质粒提取试剂盒,DNA凝胶回收试剂盒和Buffer均来自YRBIO。 DNA标记购自北京。天根公司。 pUC57质粒和DH5α菌株由医学实验室实验室维护。

1.2靶基因的合成

根据基因库中已知的人cdna-egf序列,获得了hegf-cdna全序列(nm_u),合成了egf基因的信号肽片段(nm_u,nt453nt518),并添加了hegf基因分泌肽片段(nm_u,nt3363nt3521)。由南京金穗生物科技有限公司化学合成的sp-hegf融合基因全长234bp。合成sp-hegf基因时,上游5'端引入nhei裂解位点,下游3'端引入sali裂解位点。

1.3克隆载体puc 57 hegf的构建与鉴定

取sp-hegf基因片段6μl,t4-dna连接酶1μl,puc 57质粒1μl。反应体系为:缓冲液2.5μl,DDH2O 14.5μl,16℃恒温水浴过夜。将15μl的结扎产物转化为活性细胞dh5a[4],包被氨苄西林培养基,37℃培养过夜,挑取较大的白色菌落,展开培养后提取质粒,制备ndei和hindii。双酶消化鉴定。

1.4穿梭表达质粒pyr-ads-6-hegf的构建与鉴定

分别用限制性核酸内切酶NdeI和SalI消化质粒pUC57-sp-hEGF和腺病毒穿梭质粒pYr-ads-6,并用T4 DNA连接酶将sp-hEGF基因片段消化成穿梭质粒。在pYr-ads-6上。反应系统为1.5μL:缓冲液,1μL载体DNA,7μL靶基因DNA,1μLT4 DNA连接酶和4.5μLddH2O。轻轻混合后,将混合物在16°C下连接过夜,第二天将其转化为感受态DH5a细胞,并将产物铺展在含有卡那霉素的培养基上,并在37°C下培养过夜。第二天,挑出平板上较大的白色菌落并在培养基中扩增。如质粒提取试剂盒中所述获得重组质粒pYr-ads-6-hEGF。用重组质粒双消化限制性内切酶NdeI和SalI,选择正确的阳性克隆并送至南京金斯瑞生物技术有限公司测序。

2个结果

2.1 pUC57-hEGF质粒的酶切鉴定

用Hind III和NdeI消化pUC57-hEGF质粒的阳性克隆,并切出一条含有sp-hEGF的2.4Kb载体条带和一条540bp的小条带。

2.2 pYr-ads-6-sp-hEGF质粒的酶切及亚克隆入pYr-ads-6载体的sp-hEGF片段的鉴定,通过NdeI和SalI酶切得到的阳性克隆,可切割一条约650bp的小条带和一条5.8Kb。推测sp-hEGF基因片段已被克隆到pYr-ads-6载体中。将通过测序阳性克隆和sp-hEGF基因片段获得的序列进行比对,表明构建的序列与预测的碱基序列没有区别,表明成功构建了hEGF腺病毒穿梭质粒。

3讨论

为了表达人表皮生长因子,可以通过转移到原核质粒中获得大量的重组蛋白,但原核质粒表达的重组蛋白缺乏相应的翻译后修饰,难以获得真正的活性蛋白。在真核表达系统中,分泌的蛋白质可被信号肽引导至内质网,并在修饰后可通过高尔基复合物囊泡转运至细胞外空间,从而发挥生物学作用。可以看出,蛋白质在分泌到细胞外的过程中是由信号肽介导的。大量研究表明,信号肽的主要功能是调节蛋白质前体的折叠,指导蛋白质的跨膜作用,并在蛋白质的分泌中起至关重要的作用。

目前,获得靶基因的主要方法有三种:逆转录,直接从细胞基因组中分离以及人工化学合成。人工化学合成全基因是目前最准确,最快的方法。通过搜索NCBI GenBank数据库,我们获得了4875 bp的人cDNAEGF的完整cDNA序列,该序列很难通过化学合成来合成,并且片段越大,质粒成功转移的可能性就越小。为了提高合成基因的成功率并减少随后插入载体的难度,选择了hEGF信号肽和分泌肽基因片段,使融合基因在转染细胞后能更好地分泌生长因子。现有研究表明,可以在不改变氨基酸组成的情况下人工合成DNA序列以增加蛋白质表达。尽管化学合成无法像PCR一样实现快速有效的扩增,但是它具有不需要模板和直接面对序列的优势,这可以大大缩短制备靶基因的时间。

在后续实验中,将pYr-ads-6-hEGF质粒进一步包被腺病毒,并用脂肪干细胞感染以修复全层病变。考虑到干细胞不易转染的特征,选择了腺体。病毒穿梭质粒用作hEGF表达载体。由于腺病毒载体宿主广泛,可感染分裂和非分裂细胞,转染效率高,病毒滴度可控,外源基因载量大,已成为基因治疗研究中常用的转基因载体。在本实验中选择的pYr-ads-6质粒带有绿色荧光蛋白(GFP)基因,其示踪剂有助于在随后的实验中更好地了解目标基因在转染细胞中的位置,扩散范围和扩散范围。行动阶段。如果用克隆位点NheI和SalI消化了pUC57-hEGF质粒,则应切除约250 bp的靶基因片段和2.7 Kb的大条带。但是,由于250 bp的片段不明显,因此需要消化质粒上的Hind III和NdeI,以获得与预测一致的540 bp的条带。最后,消化重组穿梭质粒pYr-ads-6-hEGF,并切出650bp小带和5.8Kb载体带。获得的靶片段符合预期,并且最初确定了重组体的正确性。此外,通过基因测序对sp-hEGF基因序列进行了分析,Gen-Bank发表的序列一致,且二者相同,证明成功构建了pYr-ads-6-hEGF腺病毒穿梭质粒。

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