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不同种质和表型当归与习用品东当归、牡丹叶当归的rDNAITS序列解析

来源:www.timetimetime.net 时间:2019-10-01 编辑:小故事

当归(Angelica sinensis)是一种常用的中草药,最早在《神农本草经》中列为中档产品。来源是当归伞状植物当归的干根。它具有活血化瘀,调节月经和缓解疼痛,润肠通便的功能。目前,它主要分布在甘肃,云南,四川,湖北,陕西等地。当归的野生资源由于过度开发而濒临枯竭。通过对当归种质资源的调查,发现当归具有紫色茎和绿色茎。此外,北川当归,在日本也被称为当归,在四川等地种植。在西藏的临zhi和其他地方,有野生当归pa等,在西藏的临zhi,当归牡丹叶的根经常被用作中药。

随着分子生物学技术的发展,出现了一些新的中药鉴定方法。 PCR直接测序是1990年代测序技术的快速发展。它具有高速,灵敏和准确的特点。核糖体DNA中内部转录间隔区(ITS)的序列发展迅速,可用于解决该属下不同物种和种的系统发育和分类学问题。近年来,该技术已应用于中药材的鉴定。本研究对当归14种不同种质和表型及其当归产物当归和牡丹叶的ITS序列进行了测序和分析,以探讨该片段在当归分子生物学水平上的鉴定意义。

1材料与方法

1.1材料

从当归和中药的14片新鲜和嫩叶,当归牡丹叶和当归中收集ITS测序序列样品。

1.2 DNA提取

用0.1 g的每种Rodrigues组织培养表面消毒方法处理新鲜的植物叶片。向细粉中加入液氮后,使用改良的CTAB方法提取总DNA,并保存在-20°C直至使用。

1.3 PCR扩增和产物纯化

PCR扩增引物是用于真核ITS扩增的特异性产物LH2和ITS4。引物均由上海圣工生物工程有限公司合成,序列为LH2:5'-GTCGAATTCGTA GGTGAACCTGCG-GAAGGATCA-3'; ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。反应溶液(以20μL/L反应体积为例):10×PCR缓冲液2μL,10mmolL-1dNTP 0.5μL,Mg2 +(25mmolL-1)2.4μL,引物LH2和ITS4(10 μmolL-1)各自1μL,Taq酶(5 UμL-1)0.1μL,DNA模板(合适的浓度)2μL,无菌三蒸馏水(3dH2O)10μL。 PCR扩增条件为:在94℃变性4min,在94℃变性1min,在50℃变性2min,在72℃变性1min,30个循环。 72°C放置10分钟,用无菌蒸馏水代替模板DNA作为空白对照。通过1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。使用QIAGEN PCR产物纯化试剂盒进行PCR产物的纯化。

1.4 PCR产物ITS序列的确定

纯化的产物用作测序反应的模板,PCR反应的引物直接用作测序引物。通过使用脱氧终止法的末端荧光标记,在正负两个方向上确定DNA序列。在ABI 377测序仪上进行测序反应。使用CLUSTAL X(1.8版)进行多重比对,使用BioEdit编辑和校正多重比对的结果,并根据EMBL和Gen-Bank上的二级结构和参考序列对ITS1和ITS2进行定位。

2个结果

根据GenBank中当归(Oliv。)Diels的ITS序列(Genebank:GU.1),确定当归和当归Diels之间的rDNA中ITS1和ITS2的边界以及三个编码区18S,5.8S。确定了26S。对14份当归个体的ITS-1,5.8S rDNA,ITS-2,18S rRNA基因3'端和26S rRNA基因5'端的总序列进行了测定,共约664 BP。 ITS1序列长度为215 bp,5.8S 162 BP,ITS2序列长度为223 bp。 Dongdanggui长663 BP,其中ITS1序列长度为216 bp,5.8S 162 BP,ITS2序列长度为221 bp。 ITS1序列的长度为215 bp,5.8S 162 BP和ITS2 223 bp。当归ITS1和ITS2中G + C%的含量分别为54.42%和55.16%。 ITS测序结果显示,当归14种不同种质的ITS序列均相同,包括紫色当归和绿色当归,野生当归和栽培当归两种表型。

将当归,东当归和牡丹叶当归的ITS序列进行比对,并计算它们的遗传距离。当归与当归之间的遗传距离为8.6,与当归之间的遗传距离为9.6,当归与当归之间的遗传距离为10.7。

3讨论

当归的植物表型可分为当归和绿茎当归,其中绿茎的茎,叶和叶鞘为绿色,与紫色当归明显不同,但从ITS序列结果来看,绿色茎当归在ITS序列和鸢尾花之间没有区别。栽培的和野生的ITS序列也相同。尽管有许多报道指出ITS序列中存在种内多态性,即在不同亚种和种群的同一基因座中有2种或更多的核苷酸类型[5-6]。然而,国外仍然有许多报道表明某些物种的基因座内和基因间同时发生进化,因此没有位点多态性[7-8]。中国一些人发现,甘草和甘草的ITS序列是相同的。不同种质和表型的当归在其ITS序列上没有变化,这可能与其ITS位点与其位点同时进化有关。不同种质和表型的当归具有很相似的遗传背景,它们之间的形态差异可能是长期栽培过程中自然进化和人工选择双重因素的结果。

当归与当归当归和牡丹叶当归之间的遗传距离表明,当归与当当当归具有更相似的遗传基础,并且两者在化学组成上都具有许多相同或相似的成分,例如含有挥发油和痰。酯,多糖等成分。目前,关于当归化学成分的研究很少。建议对其进行进一步研究,弄清其药用成分和功效,为开发和利用奠定基础。 ITS序列作为构建系统发育树并分析系统发育关系的分子标记并不是普遍适用的。用ITS序列分析不同种质和表型的当归的遗传多样性是不合适的。但是,高度保守的ITS非常适合识别当归的真实性。当归和当归当归和牡丹叶当归可以通过ITS序列鉴定。

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