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pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建研究

来源:www.timetimetime.net 时间:2019-10-07 编辑:心灵

应激蛋白Argonaute1是一种多功能蛋白,涉及各种细胞生物学过程,例如RNA干扰以及应激颗粒(SGs)和加工体(PBs)的形成。 pmCherry-C1是编码红色荧光蛋白的真核表达载体。 2015年9月至2015年11月,该研究使用基因工程技术将Argonaute1基因片段与pmCherry-C1载体连接,构建了pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒,为进一步研究该细胞的细胞生物学功能提供了方便的工具。 Argonaute1蛋白。

1材料与方法

1.1材料质粒,菌株和细胞: pmCherry-C1载体由Johan Perane博士捐赠,感受态大肠杆菌Trans1购自天津科基佳新科技有限公司,HeLa细胞来自该实验室。酶和主要生化试剂:限制性酶EcoRI,BamHI和T4 DNA连接酶购自ThermoFisher Scientific,Taq酶购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司,T/A载体(pEASY-T1)购自北京。向北京博大泰克生物基因技术有限公司购买B型少量DNA快速回收试剂盒金津生物技术有限公司,从北京索宝技术有限公司购买质粒快速提取试剂盒,从内毒素质粒提取试剂盒购买。从Promega,从Invitrogen购买Lipofectamine 2000,从Pierce购买BCA蛋白测定试剂盒,从KPL购买LumiGLo化学发光底物。抗体:兔抗人Argonaute1单克隆抗体购自CST,小鼠抗人G3BP单克隆抗体和兔抗人DCP1α抗体购自abcam,小鼠抗人樱桃红白蛋白(Cherry)单克隆抗体购自MBL,蓝色荧光(AlexaFluor350)标记的驴抗小鼠荧光二抗和绿色荧光(AlexaFluor488)标记的驴抗兔荧光二抗购自Invitrogen,辣根过氧化物酶标记的抗小鼠和抗兔IgG二抗从KPL公司购买。引物合成和基因测序由北京天一汇源公司完成。

1.2pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建

从1.2.1Argonaute 1蛋白的目标片段中提取HeLa细胞的总RNA,并用TGGACCAAGGGCAGGGCACTGGTGCCC的序列扩增Argonaute1基因。根据CDS序列(NM.2),引物序列含有EcoRI和BamHI的限制性核酸内切酶位点,即F: 5'-CCGGAATTCCATGAGGGGGACCCGGGGGGAGGGGAG-3';设计了R: 5'-CGGGCCT。 CAAGCGAAGTACATGGTGCGCA-3' ;以反转录Argonaute1cDNA为模板扩增PCR的靶片段。条件为95 DEGC 5分钟,95 30s,65 C 45s,72 C 3min,15个循环,每个循环1个循环,在50℃下20个循环,在72度下延伸10分钟,并且通过琼脂糖凝胶电泳,UV鉴定PCR产物。在灯下切下含有目标条的凝胶块。通过凝胶回收试剂盒回收靶片段,并将靶片段在25℃下与pEASY-T1(T/A载体)连接15分钟。将结合物转化到Tran1-T1感受态细胞中,并克隆到含有氨苄青霉素/卡那霉素的LB平板上。挑选出阳性克隆,并通过摇动细菌扩增质粒。用双酶消化EcoR和BamHI,并使用凝胶回收试剂盒回收和纯化目标片段。

1.2.2线性pmcherry-c1质粒载体获得pmcherry-c1质粒用质粒快速提取试剂盒提取,用ecori和bamhi双酶切,线性pmcherry-c1质粒载体经1%琼脂糖电泳完全切割分离。通过凝胶回收试剂盒回收PMCHELY-C1线性载体(约4700 bp)。在t4-dna连接酶作用下,将线性pmcherry-c1质粒载体与22℃具有相同内聚端的argonaute1功能片段连合过夜。将连接产物转化为大肠杆菌的大肠杆菌trans1菌株,在含有卡那霉素的lb平板上进行克隆筛选。筛选、摇瓶、扩增阳性克隆,提取重组质粒。

1.3pmcherry-c1-argonaute1重组质粒的鉴定

1.3.1酶切和基因测序,用ECORI和BAMHI单、双消化鉴定重组质粒pPMCHELY-C1-ARGANAUTE1,1%琼脂糖凝胶电泳证实片段大小。基因测序鉴定重组质粒。

1.3.2用western印迹法检测融合蛋白。用预先冷却的1×np-40裂解液对细胞进行裂解,在4℃和r/min条件下超声离心10min,取上清液得到全细胞裂解液,用bca蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。加入SDS负载缓冲液(50mmol/ltris-cl,2%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油,2.5%β-巯基乙醇,pH 6.8),99℃热变性10min,8%SDS-PAGE电泳;将凝胶上的蛋白质用半干旋转法转移到PVDF膜,室温下用5%脱脂奶粉在TBST溶液中封闭3小时,加入兔抗人弓形虫单克隆原抗体或小鼠抗樱花一级抗体。在4℃下孵育过夜;在TBST溶液中清洗膜3次,每次10分钟;在室温下添加辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG二级抗体2小时;在TBST溶液中再次清洗膜3分钟,每次10分钟;在基质中添加Lumiglo化学发光是暴露在暗室后的承印物。

1.3.3三色荧光共定位分析使用无内毒素质粒提取试剂盒提取无内毒素的重组质粒。将细胞接种在激光共聚焦培养皿中,并在37°C,5%CO 2的培养箱中在含有10%FBS的DMEM高葡萄糖培养基中培养。当细胞达到80%融合时,将脂质体瞬时转染到pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒中。转染后48h,将0.5mmol/L的亚砷酸盐处理1h,在室温下于4%多聚甲醛中固定10min,并用高压PBS缓冲液洗涤两次,每次5min/time。将1%的渗透液(含有0.2%TritonX-100的PBS)在室温下放置10分钟;加入1%BSA 1小时;加入G3BP(1:250)和DCP1α(1:100)一抗混合物,4在°C孵育过夜;用PBS洗涤3次,每次10分钟;加入蓝色荧光标记的抗小鼠(1:800)和绿色荧光标记的抗兔(1:800)二抗混合物,在4°C下孵育过夜;用PBS洗涤3次,每次10分钟。用不含DAPI的无细胞荧光密封溶液密封细胞,并放置过夜。通过激光共聚焦显微镜观察细胞中红色,绿色和蓝色的荧光信号。

2个结果

2.1Argonaute1目标片段的目标片段的长度约为2574 bp。

2.2线性pmCherry-C1质粒载体用EcoRI/BamHI消化完整的线性pm-Cherry-C1质粒载体,并在大约4722 bp处出现一条条带,将其纯化并回收用于随后的连接。

2.3重组真核表达质粒pmCherry-C1-Argonaute1的鉴定

2.3.1消化和基因测序分别对重组质粒进行EcoRI和BamHI的单消化和双消化。产生的条带符合预期,重组质粒基因测序结果正确,证明Argonaute1功能片段成功插入pm。 -Cherry-C1在多克隆位点上。

2.3.2融合蛋白表达将Argonaute1蛋白和Cherry蛋白融合,分子量为89.7KDa。通过蛋白质印迹检测到的蛋白条带与目的融合蛋白的分子量一致,表明成功表达了Cherry-Argonaute1融合蛋白。

2.3.3通过三色共定位转染构建的重组质粒pmCherry-C1-Argonaute1可以检测细胞中的荧光信号。当细胞受到氧化应激时,Cherry-Argonaute1可以在细胞质中形成红色的颗粒状结构。它与SGs的标记蛋白G3BP(蓝色)和PBs的DCP1α(绿色)颗粒结构共定位。

3讨论

Argonaute1蛋白家族是一类保守的蛋白,相对分子量约为100 kDa,在人,果蝇,拟南芥和其他物种中表达。 Argonaute1蛋白家族由多个成员组成,包括新月形PAZ和具有潜在核酸内切酶活性的PIWI结构域,并参与多个非编码小RNA(例如miRNA,siRNA和piRNA)的细胞生物学过程。研究发现Argonaute1是RNA诱导的沉默复合物的核心成分,与siRNA的产生,靶标mRNA的降解和细胞应激密切相关。生物体的生存环境复杂多变,人体细胞建立了相应的“应激反应系统”以应对各种外部刺激,例如氧化应激,渗透压,热休克,紫外线辐射和病毒感染,以维持生命。细胞的旺盛生命力。转录后基因调控机制是调控细胞质RNA代谢,暂时抑制应激细胞中蛋白质翻译过程,节省原料和细胞内合成代谢能量并优先表达应激的关键环节。蛋白质等。 SGs和PBs是颗粒结构,与细胞受到压力时在细胞质中形成的RNA代谢密切相关。这两个粒子结构实质上是蛋白质,核酸的集合。随着研究的进展,不断发现新的应激蛋白。

其中,Argonaute1蛋白参与细胞中SGs和PBs的形成。通过基因工程对Argonaute1蛋白进行荧光标记,可用于研究Argonaute1蛋白在细胞应激中的作用。 Cherry是四聚体Discosomasp的突变体。红色荧光蛋白,具有增强的荧光强度和抗光漂白性。 pmCherry-C1载体可将目标基因片段插入Cherry蛋白基因的C末端,形成红色的荧光标记目标蛋白质。在这项研究中,通过构建pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒,Cherry对Argonaute1蛋白进行了荧光标记。在Westernblotting实验中,抗内源性Argonaute1抗体检测到两个条带,而抗Cherry抗体检测到一个条带,表明pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒可以在活细胞中成功表达Cherry和Argonaute1。融合蛋白。当细胞受到亚砷酸盐氧化应激刺激时,樱桃标记的Argonaute1蛋白与应激颗粒(G3BP蛋白作为标记蛋白)和加工体(以DCP1α作为标记蛋白)共定位,表明Argonaute1蛋白A细胞应激和加工体。

总之,本研究成功构建了重组pmCherry-C1-Argonaute1质粒,该质粒可有效表达Cherry标记的Argonaute1融合蛋白。以上结果将有助于进一步研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病领域的生物学机制。

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